百里香酚MIC和生长曲线测定及对金葡菌Hla的作用机制（三）
2.3百里香酚对金葡菌Hla的影响
金葡菌USA300在稳定期能够产生Hla并分泌至培养液中，Hla对兔红细胞敏感，从而发生溶血现象。若细菌培养液的溶血能力下降，则说明Hla的含量减少或者生物活性受到抑制。本试验以不加百里香酚组的溶血能力为100%，当百里香酚质量浓度为16μg/mL和32μg/mL时，溶血能力分别下降至51.9%±3.7%和34.8%±2.6%，差异极显著(P<0.01)(图2a)。接着通过蛋白免疫印迹试验考察溶血能力下降的原因，结果显示：随着百里香酚质量浓度的增加，Hla蛋白条带的颜色明显减弱，说明Hla的含量减少(图2b)。Hla的编码基因为hla，RNAⅢ的转录与Hla表达呈正相关关系。RT-PCR结果表明：不同质量浓度的百里香酚对USA300的hla和RNAⅢ的转录水平与蛋白免疫印迹的结果基本一致，随着药物质量浓度的增加，hla和RNAⅢ的转录水平都降低。当百里香酚质量浓度为32μg/mL时，与对照组相比hla和RNAⅢ的转录水平分别下降至5.5%±3.0%和10.5%±2.1%，差异极显著(P<0.01)(图2c)。
图2百里香酚对金葡菌Hla的影响
注：a)不同质量浓度百里香酚与金葡菌培养上清液对兔红细胞的溶血作用；b)不同质量浓度百里香酚对金葡菌USA300 Hla表达影响的免疫印迹结果；c)不同浓度的百里香酚对金葡菌USA300的hla和RNAⅢ相对基因表达量的影响。*.P<0.05，**.P<0.01；下同。
2.4百里香酚对金葡菌USA300α-溶血素介导的人肺癌上皮细胞A549损伤的保护作用
通过Live/Dead试剂盒染色，在激光共聚焦显微镜下可观察到绿色荧光的为活细胞，红色荧光的为死细胞。试验结果表明：百里香酚可以提高由金葡菌Hla介导的A549细胞损伤的保护率(图3a~d)，随着百里香酚质量浓度的增加，死细胞数量减少，活细胞数量增加。
图3不同质量浓度百里香酚对金葡菌USA300介导的A549细胞损伤的?；ぷ饔?
注：a)未处理组；b)感染金葡菌USA300组；c)感染金葡菌USA300，并加入百里香酚使其质量浓度为8μg/mL；d)感染金葡菌USA300，并加入百里香酚使其质量浓度32
乳酸脱氢酶(LDH)是胞内酶，在细胞坏死破裂后释放到细胞外。本研究通过检测细胞培养基上清液中LDH的释放量，定量分析百里香酚对α-溶血素介导的A549细胞的保护作用。随着百里香酚质量浓度的增加，LDH的释放量降低，在质量浓度为4、8、16和32μg/mL时LDH的释放量分别为80.8%±4.8%、43.3%±5.0%、26.8%±4.0%和4.8%±2.5%(图3e)。以上结果说明百里香酚具有保护金葡菌Hla介导的A549细胞损伤的作用，且与药物质量浓度呈正相关关系。
3.讨论
α-溶血素(Hla)是细菌生长后期所分泌的一种外毒素，大小约为33 ku，多种细胞(红细胞、单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞)的细胞膜对Hla敏感。Hla可在敏感细胞的细胞膜上形成中空的七聚体圆柱体，贯穿细胞膜形成孔道，破坏其完整性，从而破坏细胞内物质的平衡，最终导致细胞裂解引起多种疾病。已有文献报道Hla在金葡菌肺炎的致病过程中起非常关键性的作用。因此，可将Hla作为抗金葡菌肺炎的新靶点。众所周知，传统的抗生素主要是通过阻碍细菌的生长和增殖达到抗菌效果，如抑制细胞壁的合成、破坏细胞膜、阻断DNA复制、干扰细菌代谢以及抑制蛋白质的合成等。传统抗生素能有效地治疗细菌感染，但是其对细菌产生选择性压力，使细菌产生耐药性。使用抗生素治疗金葡菌感染极易产生耐药性。而Hla是细菌生长的非必需物质，抑制其表达或者生物活性不会给细菌的生长造成选择性压力，因而不易产生耐药性，在抗生素耐药性如此严重的今天具有重要意义。
本研究中，百里香酚在亚抑菌质量浓度下对金葡菌的生长没有影响，但是却能通过下调hla和RNAIII的转录水平使Hla的表达量下降，是一种潜在的抗Hla的药物。目前抗Hla药物还处于试验研究阶段，抗生素仍然是治疗金葡菌肺炎的主流?？梢钥悸怯肟股亓迷黾有Ч?，这一联用思路主要是抗生素抑菌或者杀菌，抗Hla药物抑制Hla可能会有更好的效果。另外，某些抗生素(如β-内酰胺和氟喹诺酮类抗生素)在亚抑菌浓度下会增加Hla的表达，该类抗生素与抗Hla药物联用后可以弥补抗生素的不足。Hla的表达量增加还会增加其他细菌(尤其是革兰阴性菌)的生长繁殖，加重肺炎感染的症状。因此，抗生素与抗Hla药物联用在未来是一个非常受关注的热点。
4.结论
百里香酚通过下调金葡菌的hla和RNAIII的转录水平降低Hla的表达，并对金葡菌Hla介导的肺癌上皮细胞A549的损伤具有?；ぷ饔茫馓崾疽种艸la的表达对治疗金葡菌肺炎具有潜在的效果，至于效果如何还有待进一步研究。本研究尚未对百里香酚的安全性进行评价，这将是接下来要研究的内容。USA300菌株为MRSA菌株，本研究结果发现百里香酚对该菌株也有抑菌效果，但对其他耐药菌株是否同样有效果还需进一步研究。百里香酚与β-内酰胺和氟喹诺酮类抗生素联用增加治疗效果还有待于深入研究。
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