枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长抑制作用研究（一）
摘要
【目的】检测枯草芽孢杆菌JN005产生的胞外抗菌物质的稳定性和对稻瘟病菌的生物活性，及其对水稻叶瘟的防治效果。
【方法】通过不同培养基检测枯草芽孢杆菌JN005产生的抑菌物质，结合平板对峙法、光学显微镜观察、室内离体和活体接种来检测JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌拮抗活性和对水稻叶瘟防治效果。
【结果】枯草芽孢杆菌JN005能分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和β-1，3-葡聚糖酶，其胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长具有抑制作用。胞外抗稻瘟病菌物质在0℃~100℃和pH 2~12范围内活性较为稳定，且经蛋白酶K处理后不影响其活性，紫外照射12 h以及4℃保存3个月仍有活性。胞外抗菌物质能引起稻瘟病菌菌丝形态畸变，并抑制分生孢子的萌发。室内湘晚籼12号稻瘟病离体叶片接种表明，先用100倍胞外抗菌物质稀释液处理水稻叶片，24 h后接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液(1×105个/mL)，其叶瘟发病率为34.07%，效果接近稀释500倍的40%稻瘟灵EC；而先接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液，24 h后用100倍胞外抗菌物质稀释液处理，其发病率为38.52%，与稀释1500倍的75%三环唑(WP)和稀释500倍的40%稻瘟灵(EC)有显著性差异?；钐迮缥斫又质匝楸砻鳎谙嫱眙?2号秧苗长至3叶1心时，接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液前24 h喷施稀释100倍的胞外抗菌物质稀释液，其叶瘟防效为75.32%；接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液后24 h喷施稀释100倍的胞外抗菌物质稀释液，其防效为71.49%。
【结论】JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发有直接抑制作用，且对环境稳定性较好，对稻瘟病有较好的预防和治疗作用，有进一步的开发潜力。
引言
稻瘟病是最具破坏性的水稻真菌性病害之一，每年能够造成全球水稻减产10%~30%。尽管化学农药能够快速有效地防治植物病害，但过度使用会导致植物病原物的抗药性上升和并影响食物安全。由于来自微生物代谢产物研发的生物农药负面影响小、环境相容性和有害生物防治效果好，微生物代谢产物的研发成为全球农药产业发展的重要途径。
生防细菌目前主要包括芽孢杆菌、假单胞菌及链霉菌，其中芽孢杆菌是一类内生芽孢的革兰氏阳性杆菌，其具有产生多种生物活性化合物的能力，因此是商业开发的首选。芽孢杆菌的生防机制包括竞争作用、拮抗作用、诱导植物抗病性三方面，拮抗作用是指生防菌在其生长代谢过程中产生的各种活性物质抑制病原菌的生长，在植物病害的防治中发挥着重要作用。近年已报道了芽孢杆菌的各种抗菌物质，如酶类、脂肽类、蛋白类物质，其活性范围广、毒性低、对环境友好，被认为是拮抗植物病原物的潜在药剂。迄今为止，我国新登记的防治稻瘟病的芽孢杆菌制剂有19种，其中枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的分别为15种、3种和1种。
本实验室于2014年从湖南桃江山区单季稻感稻瘟病品种湘早籼24号的感病稻丛的健康稻株中分离出817株菌株，采用平板对峙法，筛选出1株对稻瘟病菌具有高效抑制作用的枯草芽孢杆菌JN005，并已获得中国国家发明专利。本研究初步分析枯草芽孢杆菌JN005菌株的抑菌物质，从中提取出对稻瘟病菌有拮抗效果的胞外抗菌物质，并对其抗菌活性和稳定性进行了测定，同时，进一步研究了胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长和致病性的影响，研究结果可为枯草芽孢杆菌JN005菌株的开发应用提供依据。
1材料与方法
1.1供试材料
供试拮抗菌枯草芽孢杆菌JN005是本课题组从湖南桃江山区单季稻感病品种湘早籼24号的感稻瘟病稻丛的健康稻株中分离获得，供试病原菌稻瘟病菌TJ40-2-1，均由湖南农业大学植物病原微生物及水稻病害实验室保存。
感稻瘟病品种湘晚籼12号来自湖南金色农丰种业有限公司。
40%稻瘟灵(EC)和75%三环唑(WP)分别来自江苏龙灯化学有限公司和上?；α镆┮担ㄏ囊兀┕煞萦邢薰?。
1.2 JN005菌株抑菌物质的初步测定
将5μL的JN005菌株发酵液分别接在脱脂牛奶琼脂培养基、纤维素酶选择性培养基、0.2%可溶性淀粉培养基、β-1，3-葡聚糖酶培养基、胶体几丁质酶培养基和CAS培养基平板上，干燥后置于28℃恒温培养箱中培养，于24 h、48 h和72 h观察菌落的生长情况和水解圈，每处理重复3次。
在NA培养基平板上划线接种JN005菌株，同时在PDA培养基平板上接种6 mm稻瘟病菌菌饼，置于28℃恒温培养箱中培养24 h后，移去两个培养皿的皿盖，将皿底相对而扣，上皿为接种稻瘟病菌菌饼平板，下皿为接种JN005菌株平板，并用封口膜将培养皿外侧固定封口，置于28℃恒温培养箱中继续培养3~5 d后进行观察，每处理重复3次，设不接JN005菌株的空白对照。
将JN005菌株接在NB培养液中，置于30℃、200 r/min摇床中发酵培养5 d后，4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，用0.22μm细菌过滤器过滤得代谢产物液。采用硫酸铵分级沉淀法提取胞外抗菌物质：在常温条件下，将固体硫酸铵研磨成粉末状，边缓慢加入代谢产物液中边轻轻搅动液体直至充分溶解，使其饱和度达到80%，置于4℃下静置24 h后析出深褐色沉淀，4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，取沉淀溶解于PBS缓冲液中，再将溶解好的液体装于透析袋(8 000~14 000 D)中并置于相同PBS缓冲液中24 h透析除盐，透析液用0.22μm细菌过滤器过滤后，将液体体积调整为代谢产物液体积的1/20，获得胞外抗菌物质粗提液，用考马斯亮蓝法测定样品浓度并检测其抑制稻瘟病菌活性。按平板对峙法将6 mm稻瘟病菌菌饼接在PDA培养基平板中央位置，在距离菌饼中心左右25 mm处用6 mm打孔器各打一孔，向内各注入60μL的胞外抗菌物质粗提液(浓度为1.54 mg/mL)，置于28℃恒温培养箱中培养5 d后测量菌落直径，计算抑菌直径[抑菌直径(mm)=对照组菌落直径(mm)–处理组菌落直径(mm)]，每处理重复3次，设PBS缓冲液的空白对照。
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