?微生物农药之绿僵菌（Metarhizium anisopliae）计数及登记
绿僵菌属于球壳菌目麦角菌科，是一类昆虫病原丝状真菌，最早由Metschnikoff于1879年发现并命名。其菌落初期呈白色茸状，产孢阶段中央形成绿色至灰黑色的分生孢子堆，基质反面呈淡褐色或赭色。分生孢子单细胞、链状排列，形态为长椭圆形或圆柱形（3.0-5.0μm×1.0-2.0μm），与白僵菌的球形孢子显著不同。
绿僵菌属包含12个种，其中农业应用最广泛的是金龟子绿僵菌（M.anisopliae）、黄绿绿僵菌（M.flavoviride）、平沙绿僵菌（M.pingshaense）等。其最适生长温度为24-26℃（10-30℃均可发育），最适pH 6.9-7.4，耐受pH 4.7-10。分生孢子在干燥条件下可保存3年以上，但60℃高温会迅速失活。
作为重要的生物防治资源，绿僵菌通过侵染害虫体壁实现杀虫效果，对鳞翅目、鞘翅目等700余种农业害虫具有广谱活性，且对人畜低毒、环境友好，是替代化学农药的关键微生物资源。
绿僵菌生物农药的检验检测方法
1.鉴别方法
形态学鉴定：
菌落特征：观察橄榄绿色孢子层及链状孢子排列。
显微特征：光学显微镜下（400×/1000×）确认分生孢子形态（椭圆形/圆柱形）及链状排列模式（区别于白僵菌的球形孢子）。
分子生物学鉴定：
ITS序列分析：通过内转录间隔区（ITS1-5.8S-ITS2）序列比对区分种间差异。
EF1-α基因测序：延伸因子1-α基因（EF1-α）用于菌株级分类。
PCR分子标记：检测特异性基因片段（如tekh*基因）。
质谱分析：
MALDI-TOF MS：通过蛋白质指纹图谱快速鉴定菌株特征。
2.效价测试
活孢子数测定（稀释涂布平板法）：
1.样品制备：取10g（或10mL）制剂加入90mL无菌0.05%吐温-80盐水，振荡30min制成10?1悬液。
2.梯度稀释：依次稀释至10??、10??、10??梯度。
3.培养计数：取0.1mL稀释液涂布PDA平板，25-28℃避光培养3-5d，选取菌落数30-300的平板计数。
4.计算公式：活孢子数（CFU/g/mL）=平板平均菌落数×稀释倍数×10（0.1mL换算系数）。
孢子萌发率检测（载玻片培养法）：
1.悬液制备：调整孢子浓度至1×10?-1×10?CFU/mL。
2.培养观察：5μL悬液滴加至SDAY培养基载玻片上，25-28℃培养24-48h。
3.萌发判定：显微镜下统计“芽管长度＞孢子直径1/2”的萌发孢子占比，计算萌发率（%）=（萌发孢子数/总孢子数）×100%。
生物活性测定：
靶标害虫毒力实验：通过浸渍法或喷雾法处理害虫（如番茄潜叶蛾），测定半致死浓度（LC??）和半致死时间（LT??）。
3.质量控制
杂菌检测：参照GB/T 19567.2-2023，营养琼脂培养48h后统计非目标菌落数（污染率≤1%）。
理化指标：pH值（6.0-7.5）、水分含量（粉剂＜8%）、悬浮率（≥70%）。
安全性评估：对非靶标生物（如天敌昆虫）及环境无显著负面影响。
登记查询
中国
在中国，绿僵菌属于微生物农药，需经农业农村部农药检定所登记。已有多种商品化制剂（如绿僵菌可湿性粉剂、悬浮剂等）获得农药登记证，用于防治蝗虫、白蚁等：其中：
针对蝗虫的登记制剂（如200亿CFU/g可湿性粉剂）主要用于内蒙古、新疆等草原蝗区的防治，年应用面积超过1000万亩；
针对白蚁的登记制剂（如100亿CFU/mL悬浮剂）广泛应用于房屋建筑、园林树木的白蚁防治，替代传统的化学杀虫剂（如氯菊酯）；
针对蛴螬的登记制剂（如300亿CFU/g微胶囊剂）在东北玉米产区、华北花生产区的应用面积逐年扩大，2023年应用面积超过500万亩。
欧盟
欧盟对微生物农药的管理由欧盟农药法规(Regulation(EC)No 1107/2009)管辖。Metarhizium anisopliae特定菌株（如Metarhizium anisopliae var.anisopliae BIPESCO 5/F52）已被列入欧盟批准清单，可作为活性物质使用。
美国
在美国，绿僵菌制剂由EPA管理，归类为生物农药（Biopesticides）。部分菌株（如Metarhizium anisopliae strain F52）已获EPA登记，用于农田害虫与草坪害虫的防治,以下是具体信息：
草坪害虫防治：strain F52制剂用于防治高尔夫球场、公园草坪的蛴螬（如日本金龟子幼虫），施药后防效可达80%以上，且对草坪草无药害；
有机农业防治：strain ARSEF 3244制剂获得美国农业部（USDA）的“有机认证”，可用于有机蔬菜（如lettuce、spinach）、有机水果（如草莓、蓝莓）的蚜虫、蓟马防治；
公共卫生防治：部分菌株的制剂用于防治城市公园、居民区的蚊子幼虫，替代化学杀虫剂（如吡虫啉），减少对水体生态的破坏。
以上方法遵循《绿僵菌、白僵菌生物农药检验操作规程》（SN/T 2374-2009）及NY/T 1153.6-2013标准，确保产品质量与田间防效。
相关新闻推荐
1、CYP720B1基因突变型莱茵衣藻提高铜离子耐受性及吸附效率
2、基于微生物生长曲线测定仪研发导管尖端的自动化培养鉴定方法