双黄连及各药耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线、毒力因子的影响（四）
3.6 双黄连对生物被膜形成的影响
利用不同浓度的双黄连预处理后，检测其对生物被膜形成的影响。通过结晶紫染色剂对生物被膜进行染色，观察到双黄连以剂量依赖性的方式抑制USA300生物被膜的形成。与对照组相比，ΔsrtA组未见生物膜的形成，1/8 MIC浓度下的双黄连显著抑制生物被膜的形成，1/32 MIC浓度时吸光度值与对照组相差不大。见表4。
表4 亚抑菌浓度的双黄连对MRSA生物被膜形成影响（x ± s）
| 组别 | 生物被膜形成（OD595） |
|---|---|
| 对照组 | 2.28 ± 0.06 |
| 1/2 MIC | 1.15 ± 0.08 * |
| 1/4 MIC | 1.34 ± 0.07 ** |
| 1/8 MIC | 1.94 ± 0.23 |
| 1/16 MIC | 2.17 ± 0.04 |
| 1/32 MIC | 2.36 ± 0.10 |
| ΔsrtA | 0.21 ± 0.02 * |
| 注：与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n=3。 | |
3.7 双黄连中各药对生物被膜形成的影响
生物被膜实验观察双黄连中单味药物对生物被膜形成的抑制作用，结果显示连翘、金银花对生物膜形成的抑制作用浓度分别为1/2 MIC、1/4 MIC，而黄芩则在1/32 MIC浓度时显示出对生物膜的抑制作用。见表5。
表5 亚抑菌浓度的双黄连中各药对生物被膜形成的影响（x ± s）
| 组别 | 生物被膜形成（OD595） | ||
|---|---|---|---|
| 连翘 | 金银花 | 黄芩 | |
| 对照组 | 2.35 ± 0.02 | 2.28 ± 0.27 | 2.59 ± 0.16 |
| 1/2 MIC | 1.29 ± 0.03 * | 0.67 ± 0.10 ** | 0.80 ± 0.08 *** |
| 1/4 MIC | 2.33 ± 0.06 | 0.78 ± 0.12 * | 0.77 ± 0.02 *** |
| 1/8 MIC | 2.34 ± 0.10 | 2.23 ± 0.25 | 1.10 ± 0.07 ** |
| 1/16 MIC | 2.43 ± 0.11 | 2.32 ± 0.24 | 1.22 ± 0.06 |
| 1/32 MIC | 2.36 ± 0.10 | 2.34 ± 0.26 | 1.92 ± 0.10 |
| ΔsrtA | 0.37 ± 0.07 | 0.24 ± 0.05 ** | 0.33 ± 0.05 |
| 注：与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n=3。 | |||
3.8 分子对接技术探讨双黄连的主要活性成分与SrtA的结合能力
根据TCMSP数据库筛选标准，选择口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18%的化合物作为活性成分，共检索到双黄连中三味中药的去重活性成分75个。其中，包含金银花24个活性成分，黄芩36个活性成分，连翘15个活性成分。随后将75个活性成分分别对调控毒力因子关键靶点SrtA进行分子对接。一般结合能大于-4.0 kcal·mol?1表示受体和配体之间亲和力良好，结合能超过-7.0 kcal·mol?1则表示受体和配体之间具有强烈的亲和力。结果显示结合能排名前5的活性成分coptisine、4,5'-retro-β,β-Carotene-3,3'-dione, 4',5'-didehydro-、β-amyrin acetate、beta-carotene、5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone均对SrtA有较强的结合能力。见表6。使用Pymol对结合能排名前五的结果进行可视化处理。见图6。
表6 结合能排名前5小分子化合物与SrtA分子对接结合能
| 化合物 | Molecule Name | 结合能 / kcal·mol?1 |
|---|---|---|
| MOL001458 | coptisine | -8.8 |
| MOL003062 | 4,5'-retro-β,β-Carotene-3,3'-dione, 4',5'-didehydro- | -8.8 |
| MOL003344 | β-amyrin acetate | -8.7 |
| MOL002773 | beta-carotene | -8.4 |
| MOL012245 | 5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone | -8.4 |
4 讨论
传统抗生素治疗大多以抑菌或杀菌为目的对细菌造成巨大生存压力，因此MRSA对β-内酰胺类抗生素具有高耐药性。临床上β-内酰胺类抗生素的滥用激活了细菌的附属调节因子SarA，上调毒力因子的表达，增强MRSA感染的严重程度。此外，在亚抑菌浓度下β-内酰胺类抗生素还通过上调Hla、杀白细胞素、肠毒素及表面蛋白 SpA等增强MRSA的致病性。与抗生素相比，中药的直接杀菌能力虽然较弱，但抗菌机制表现更加全面。研究表明中药及其有效活性成分在亚抑菌浓度下能有效抑制细菌生物被膜形成、细菌黏附及运动、细菌毒素合成等，减弱细菌致病性的同时减缓耐药性的产生。
本研究发现双黄连整方在MIC及以上浓度对MRSA具有抑制效果，在亚抑菌浓度影响毒力因子Hla及SrtA的活性，减弱MRSA的毒力。Hla是大多数S. aureus分离株分泌的一种孔隙外毒素，具有溶细胞和溶血活性，还可干扰免疫细胞功能、抑制炎症反应、干扰细胞信号通路、逃避巨噬细胞的杀伤逃避宿主免疫等。靶向Hla的药物可以减轻或预防S. aureus感染引起的伤害，目前以Hla为治疗靶点的药物研究主要包括减少Hla的表达、拮抗或中和Hla的作用两个方面。本研究以Hla导致的兔红细胞溶解程度作为指标，从结果中可以看出，亚抑菌浓度的双黄连不仅抑制Hla的表达，同时还具有中和Hla毒性的作用。此外，生物被膜在感染过程中也发挥关键作用，其可促进细菌在宿主组织中的定植并抵抗宿主免疫系统的清除。致密的生物被膜为S. aureus提供了一层厚防护层，妨碍抗生素药效的正常发挥，增加耐药性。生物被膜的形成可由SrtA参与调节，共同参与?；. aureus免受抗菌药物的攻击。FRET结果表明双黄连抑制了SrtA活性，且亚抑菌浓度的双黄连在1/8 MIC浓度时对生物膜出现显著抑制。提示双黄连可通过抑制SrtA的方式抑制了生物被膜的形成，使药物能向更深层渗透，抑制深层细菌达到减弱耐药性的目的。随后通过分子对接结果对双黄连中可能发挥抑菌作用的主要活性成分与SrtA靶点的结合能力进行初步预测，结合能大小排名前5的活性成分coptisine、4,5'-retro-β,β-Carotene-3,3'-dione, 4',5'-didehydro-、β-amyrin acetate、beta-carotene、5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone可以作为抑制SrtA表达的有效化合物，已有研究表明这些小分子具有广泛的生物学活性，具备开发成为新型抗MRSA药物的潜力。
双黄连整方抗毒力效果显著，与整方思路一致，我们进一步对其进行拆方探究其各药疗效，单味药中连翘抑菌能力强，在亚抑菌浓度下只影响溶血活性及生物被膜的形成但不抑制细菌的生长。金银花、黄芩不仅影响溶血活性以及生物被膜形成，还对SrtA活性产生抑制作用。其中金银花溶血效果强，在1/32 MIC浓度时即可显著抑制和中和Hla的作用，而黄芩在相同浓度下对生物被膜抑制作用显著，三药配合使用，使得整方在高浓度时有较强的抑菌能力，在亚抑菌浓度下还能通过抑制S. aureus毒力因子的释放及破坏其活性结构等多种形式减轻S. aureus侵袭能力。
双黄连方中金银花、连翘相伍既能疏散表之风热，又能清热解毒以防邪热内陷，配以苦寒之黄芩善清上焦火热增强金银花、连翘清热解毒之功，三药合用共奏辛凉解表、清热解毒之功。已有研究表明，其活性成分如绿原酸、黄芩苷、连翘苷具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、解热抗炎和免疫调节等多重功效。在开发对MRSA有效的新型药物过程中，中药作出了极大的贡献，也给我们提供了许多新的视角。与传统抗生素相比，中药可通过提高人体的免疫力、抑制并缓解细菌毒素的致病性、减轻药物对细菌耐药产生等多途径产生抗菌作用，为临床治疗感染性疾病提供新思路。本研究侧重于从中药复方抑制MRSA毒力因子的角度，阐述其减缓耐药性的作用机制。然而中药复方治疗疾病具有多靶点、多维度的特点，从传统中药中挖掘其活性成分，开发治疗MRSA新型药物将是进一步研究重点。
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