老年萎缩性胃炎患者幽门螺杆菌根治方法及药物敏感性研究（二）
2.2根治方案的选择
对于Hp培养结果呈阳性者，采用铋铋剂四联[枸橼橼酸铋铋钾+质子泵抑制剂(PPI)+2种抗生素]或者无铋铋剂三联治疗，均治疗14d?？股匕ò⒛髁帧⒖死顾?、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑(北京索莱宝科技有限公司生产)。遵循安全、有效的治疗标准。治疗期间禁止吸烟、饮酒、食用辛辣刺激食物，禁止服用胃肠道损伤药物，若出现严重不良反应则应返院评估。治疗完成后患者停药4~8周返院复查13C-UBT,若检测结果呈阴性则判定为根治,否则为根治失败。
2.3克拉霉素耐药性分析
采用琼脂稀释法测定药物最低抑菌浓度。将1~2μl的Hp菌液(0.5麦氏比浊管浓度)分别接种于含有不同浓度的克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四环素的哥伦比亚血平板上，以无抗生素药物的血琼脂平板、质控菌株NCTC11637(上海北诺生物科技有限公司提供)为阴性对照。将平板置于厌氧罐中，控制氧浓度，加入适量无菌双蒸水，37℃条件下培养5d。最终以无细菌生长的最低抗生素浓度为最小抑菌浓度，根据美国临床试验标准委员会制定的耐药临界值范围进行判定，克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四环素的临界值分别为的1μg/ml、8μg/ml、8μg/ml、2μg/ml、2μg/ml，超过以上临界值则表示存在耐药性。
2.4克拉霉素耐药菌株突变位点分析
用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)提取Hp基因组DNA,并以此为模板设计23S rRNA引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。正向引物:5’-GGACGCATAGGGTTAAGC-3’;反向引物:5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCC-3’。扩增片段为715 bp。PCR反应体系:Es Taq Master Mix 25μl,DNA模板2μl,正、反向引物各1μl(10μmol/L),ddH2O 1μl。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min,共30个循环;72℃延伸10 min。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并测序(由北京六合华大
基因科技股份有限公司完成),采用ClustalW软件与国际标准菌株U27270的23S rRNA基因(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对分析测序结果,寻找突变位点。
2.5统计学处理
采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计数资料以例数(百分数)的表示,进行X2检验。采用Logistic回归法分析老年萎缩性胃炎患者发生Hp感染的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。
3、结果
1 Hp感染情况及危险因素分析
148例老年萎缩性胃炎患者中检出Hp感染108例，感染率为72.93%。经多因素Logistic回归分析显示，吸烟、暴饮暴食、进食辣食、有家族性胃肠道疾病史是老年萎缩性胃炎患者发生Hp感染的危险因素(均P<0.05),进食酸奶是Hp感染?；ひ蛩?P<0.05)(表1)。
表1 Hp感染危险因素分析
2 Hp根治方案效果比较
108例患者经治疗后88例(81.48%)Hp根治，其中PPI+阿莫西林+克拉霉素、PPI+枸橼橼酸铋铋钾+替硝唑+克拉霉素治疗方案的根治率超过80%。其他方案的根治率为66.67%~83.33%，差异无统计学意义(x2=2.180,P=0.848)(表2)。
表2 Hp不同治疗方案根治情况
3 Hp药物敏感性
药敏检测显示，Hp对克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四环素的耐药率分别为35.19%、13.89%、41.67%、53.70%和18.52%(表3)。
表3 Hp药物敏感性
44克拉霉素耐药基因突变位点分析
108株Hp中共成功分离出克拉霉素耐药菌株38株，提取基因组以及PCR扩增后获得715 bp大小的基因片段。ClustalW比对分析显示，成功测序22株克拉霉素耐药菌株23SrRNA基因，共有6个突变位点，A1821G、G1826A、T1830C、A2143G、T2182C、A2223G，其中A1821G、G1826A、T1830C存在于所有(耐药、敏感)菌株中。12株耐药菌株存在A2143G突变，突变率为54.55%;20株耐药菌株存在T2182C突变，突变率为90.91%;8株耐药菌株存在A2223G突变,突变率为36.36%(表4)。
表4 Hp克拉霉素耐药基因突变位点分析
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