高效裂解多重耐药金黄色葡萄球菌噬菌体YNP1生物学特性研究（一）
摘要
为探索应用于治疗奶牛乳腺炎的噬菌体及裂解酶，从上海某奶牛场污水样品中分离、纯化金黄色葡萄球菌的裂解性噬菌体，分析其生物学特性。采用双层琼脂平板法分离、纯化噬菌体，观察噬菌斑特征；通过电镜观察噬菌体形态特征；测定其裂菌谱、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性，并原核表达相关的裂解酶。结果显示：本研究分离、纯化得到一株噬菌体，命名为vB_SauM_YNP1（YNP1）；透射电镜观察YNP1的头部呈二十面体结构，具有收缩性尾部，尾部的末端具有清晰的尾丝以及暴露出的尾管，属于肌尾噬菌体科；该噬菌体的潜伏期为10 min，暴发期为50 min，裂解量为71；最佳感染复数为1，能够高效裂解引起奶牛乳腺炎的MRSA菌株，可形成圆形、透明、边缘整齐的噬菌斑，效价为109 PFU/mL；基因组测序和比对结果表明，YNP1全基因组全长约为143.5 kb，（G+C）%含量为30.80%；YNP1的基因组中具有编码细菌细胞壁水解酶（裂解酶）的基因，通过原核表达，得到该裂解酶，命名为LysYNP1，平板裂解实验证实该裂解酶能够高效杀死奶牛乳腺炎耐药菌株。结果表明，噬菌体及裂解酶的高效裂菌特性使其在临床治疗奶牛乳腺炎方面具有广阔的应用前景。
1 材料与方法
1.1 菌株、裂解酶和污水样本来源
9株患乳腺炎的乳汁中分离的多重耐药金黄色葡萄球菌菌株：JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、JY-5、JY-6、JY-7、JY-8、JY-9，4株患乳腺炎的乳汁中分离的其他多重耐药葡萄球菌：SH-1、SH-2、SH-3、SH-4，11株MRSA菌株：USA300、RN4220、PNB25、DL57-2、B52、05Q132、361、386、439、575、702、823、948，大肠杆菌Min27，均为本实验室分离、鉴定和保存；大肠杆菌实验菌株MC1061、无乳链球菌ATCC13813和猪链球菌HA9801均为实验室保存菌株；BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物公司；pET28a(+)载体由本实验室保存和提供。LysJD为本实验室制备、保存的裂解酶，用于本实验的裂解酶对照实验。分离噬菌体的污水样本主要来自奶牛场的环境污水、粪便污水、饮水槽以及奶牛乳房冲洗液等。
1.2 主要试剂
SM缓冲液、PBS缓冲液、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、SDS-PAGE试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯甲烷（氯仿）购自国药集团化学试剂有限公司；2×PrimeSTAR Max Premix购自宝日医生物技术（北京）有限公司；胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。
1.3 噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化步骤参考傅强等的方法并略有改动。将污水样本分装于50 mL离心管，2770×g离心20 min后，取上清液用0.22 μm的滤器进行过滤，以除去污水样本中的细菌。为了富集污水中可能存在的噬菌体，将上清液分别与从患乳腺炎的乳汁中分离的9株处于对数生长期（OD600=0.5~0.7）多重耐药金黄色葡萄球菌菌株37℃、200 rpm振荡培养过夜后，4℃、1790×g离心20 min，收集上清液，用0.22 μm的滤器进行过滤除菌。取100 μL上清液与100 μL相对应的菌液混合10 mL 0.75%琼脂LB培养基，铺板于1.5%琼脂LB培养基之上，37℃过夜培养。次日，用无菌枪头挑取透明噬菌斑进行纯化。每个噬菌斑都需要重复分离3次，直至观察到均一稳定的噬菌斑形态。
1.4 噬菌体效价的测定
现采用丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长曲线分析系统进行测定。将系列稀释的噬菌体液与处于对数生长期的敏感宿主菌液混合，加入专用检测板中。系统自动进行延时成像与图像分析，通过实时监测和量化细菌生物量的变化，精确计算出导致细菌裂解的噬菌体滴度（PFU/mL），此方法可替代传统的手工计数方法。
1.5 噬菌体的浓缩及透射电镜观察
采用NaCl-PEG8000进行噬菌体颗粒的浓缩，然后取20 μL浓缩后的噬菌体液滴加于铜网，采用磷钨酸进行负染，通过120 kV透射电镜观察噬菌体形态。
1.6 噬菌体的生物学特性
1.6.1 裂菌谱的测定
噬菌体裂菌谱通过双层平板实验和斑点实验（spot test assay）进行，裂解菌株包括实验室分离和保存的金黄色葡萄球菌、其他葡萄球菌、猪链球菌、无乳链球菌和大肠杆菌。
1.6.2 噬菌体的热稳定性测定
取效价为102 PFU/mL的噬菌体1 mL置于无菌EP管中，并分别放于30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃的水浴中作用1 h，待作用时间结束后立即取出置于冰上冷却，用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
1.6.3 噬菌体的pH稳定性测定
分别将培养基调至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0、13.0，过滤除菌。各取900 μL不同pH的培养基至1.5 mL EP管中，分别加100 μL噬菌体（108 PFU/mL），并在37℃水浴中孵育1 h，双层琼脂平板法测定其滴度，评价噬菌体pH稳定性。
1.6.4 噬菌体的紫外线灭活实验
取2 mL噬菌体（108 PFU/mL），置于35mm无菌培养皿中，于紫外灯下照射0、15、30、45、60、75 min后，双层平板法测定噬菌体的滴度，评价噬菌体对紫外线的敏感性。
1.6.5 噬菌体的氯仿敏感实验
将噬菌体上清液（108 PFU/mL）与氯仿按照0、1%、2%、5%的比例进行混合，置于37℃培养30 min后，各取上层液体100 μL进行噬菌体滴度测定，评价噬菌体对氯仿的敏感性，推断噬菌体是否含有脂类物质。
1.6.6 噬菌体的最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）
分别测定菌液浓度及噬菌体效价，按照感染复数分别为0.01、0.1、1、10、100的比例将噬菌体与指示菌SH-4菌液混合，培养2 h分别测定各个条件噬菌体的效价，其中噬菌体效价最高的MOI即为最佳感染复数。
1.6.7 噬菌体的一步生长曲线测定
现采用丹麦Biosense公司oCelloScope系统进行实时、自动的一步生长曲线分析。将噬菌体与指示菌按最佳MOI混合后加入检测板，系统置于恒温腔室（37℃）中，自动进行连续、实时的显微成像。通过软件分析细菌浓度（生物量）随时间的变化，自动绘制生长/裂解动力学曲线，精确识别潜伏期、裂解期和平台期，并计算暴发量。
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