芳香化酶细胞色素P450对胶质瘤细胞生长曲线、细胞周期及分化的作用（上）
摘要
目的 在人胶质母细胞瘤细胞系SHG-44细胞中检测到芳香化酶细胞色素P450(AROM)表达的基础上，探讨AROM对胶质瘤细胞生长增殖及分化的作用。方法 通过构建反义AROM真核表达载体，转染SHG-44细胞，利用流式细胞仪、MTT法、免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)等技术，观察封闭AROM基因表达后细胞生长曲线、细胞周期及中间丝蛋白GFAP和Vimentin表达的变化。结果 成功构建了反义AROM真核表达载体PCI/as-AROM，并使AROM的表达封闭达50%以上。SHG-44细胞在转染了PCI/as-AROM和空载体PCI-neo后，生长曲线、细胞周期无明显变化，但GFAP免疫荧光强度减弱而Vimentin免疫荧光强度增强。结论 反义AROM可能对SHG-44细胞增殖无明显影响，但对神经胶质瘤细胞的分化有一定的抑制作用。
芳香化酶细胞色素P450(Aromatase, AROM)又名雌激素合成酶，是细胞色素P450超家族中的一员。芳香化酶不仅存在于绝经后妇女的卵巢、胎盘及脂肪组织中，而且在中枢神经系统发育中有广泛表达。现有的研究资料表明，AROM的表达与脑发育密切相关，而且可介入神经细胞的早期发育分化。但在外周组织，AROM的表达常常与一些肿瘤如乳腺癌、肺腺癌的发生相关。而AROM的表达与神经系统肿瘤是否相关？我们在以神经胶质母细胞瘤细胞系SHG-44为神经系统失分化状态的细胞模型研究中首次检测到AROM的基因表达(待发表)。为了进一步探讨AROM对胶质瘤细胞的作用，本研究拟采用反义核酸技术，构建反义AROM真核表达载体，转染SHG-44细胞，观察封闭AROM基因表达后对细胞生长及分化的影响，进一步探讨AROM对神经肿瘤细胞发育分化的作用，丰富对脑AROM的认识。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 人恶性胶质母细胞瘤细胞株SHG-44 由本校附属西南医院病理研究所卞修武教授提供。
1.1.2 质粒与菌株 含有小鼠卵巢AROM开放阅读框860 bp的质粒PUC119，由日本Harada教授惠赠。真核表达载体选用PCI-neo，含Amp抗性及neo抗性基因。
1.2 方法
1.2.1 表达载体构建 按常规基因亚克隆技术操作。用EcoRⅠ从PUC119质粒中将860 bp的AROM片段切下并连接于真核表达载体PCI-neo中，用XhoⅠ、BamHⅠ对重组质粒插入方向进行鉴定并筛选出反向重组子。
1.2.2 基因转染及抗性克隆筛选 在6孔培养板中，每孔接种2×105个细胞，37 ℃培养细胞至50%～80%融合时，采用基因转染试剂FuGENE? 6 Transfection Reagent (BM公司)分别进行PCI/as-AROM表达质粒及空质粒PCI-neo转染(方法按说明书)。转染48 h后，按1∶8将细胞传代，待其贴壁后加入G418 (600 μg/ml)的选择培养基培养4周(同时设立未转染细胞为对照)，3～4 d换液1次，观察抗性克隆生长情况。待抗性克隆出现后挑取细胞克隆扩增。分别对PCI/as-AROM表达质粒及空质粒转染细胞进行以下检测。
1.2.3 转染细胞的AROM表达 收集对照细胞及转染细胞，用75%乙醇固定30 min后进行AROM免疫荧光染色，一抗AROM抗血清(1∶100)，二抗FITC标记的兔抗鼠IgG(1∶100)。细胞洗涤后进行FCM检测，计数1万个细胞中AROM的平均荧光强度。每组样本量2瓶，重复2次。结果进行双样本χ2检验统计学处理。
1.2.4 细胞形态观察 常规倒置显微镜和HE染色。
1.2.5 细胞生长曲线 以时间为横轴、细胞吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.2.6 细胞周期 收集培养细胞，70%冷酒精固定，0.01% PBS漂洗后以含1% RNA酶的碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色30 min进行FCM检测。
1.2.7 免疫荧光染色 采用间接免疫荧光法?？笹FAP(1∶100)，抗Vimentin(1∶100)，37 ℃孵育1 h，FITC标记二抗37 ℃ 30 min，各步骤间用PBS (pH 7.2)充分漂洗，磷酸甘油封片，于Leica TCS NT激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察摄片并进行荧光强度半定量检测，每组重复3次，结果进行χ2检验统计学处理。
2 结果
2.1 反义AROM真核表达载体的成功构建
可疑重组子经EcoRⅠ酶切后能释放出860 bp的目的片段，为阳性重组子。再进一步用XhoⅠ和BamHⅠ分别酶切，根据酶切图谱切下的不同的片段可鉴定出AROM cDNA的插入方向如图1所示。正向重组子经XhoⅠ切成700 bp和5.63 kb两片段，经BamHⅠ切成3.0 kb和3.3 kb两片段。而反义重组子经XhoⅠ切成1.6 kb和6.18 kb两片段；经BamHⅠ切成3.9 kb和2.4 kb两片段。将所获得的反义重组子命名为PCI/as-AROM。
图1 重组质粒鉴定