基于生长速率法优化放线菌发酵培养基和发酵条件（二）
1.2.3菌株发酵培养基优化及发酵条件优化
（1）菌株发酵培养基的优化。将11种不同的液体培养基各100 mL分别添加至250 mL锥形瓶中，然后加入种子液发酵，参照1.2.2-(3)的方法测定抑菌活性，筛选出最优的培养基作为后续试验的基础培养基。
采用单因素试验法，在筛选出的基础培养基上，以葡萄糖、大米、小米、玉米面、蔗糖、燕麦、麦芽糖、淀粉、乳糖、甘露醇作为碳源；以酸水解酪蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硫酸铵、酵母膏、胰蛋白胨、大豆粉、鱼蛋白胨、麦芽粉、蛋白胨作为氮源，参照1.2.2-(3)的方法测定抑菌活性，筛选出3种较好的氮源和碳源。
利用交叉组合试验，将筛选出的3个碳源和3个氮源进行交叉组合，确定最优的碳源和氮源组合，参照1.2.2-(3)的方法进行抑菌活性测定，得到最优碳氮源组合。
以最优碳氮源组合固定碳源或氮源，将氮源或碳源浓度分别设置为5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，参照1.2.2-(3)的方法测定抑菌活性，确定最优碳源、氮源浓度为最优发酵培养基配方。
（2）菌株发酵条件的优化。在最优发酵培养基下，优化菌株的发酵条件。采用单因素试验，分别选择不同的发酵初始pH：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的发酵时间：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d；不同的接种量：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；250 mL锥形摇瓶中不同的装液量：75、100、125、150、175、200 mL。参照1.2.2-(3)的方法测定抑菌活性，确定最优发酵初始pH、发酵时间、接种量和装液量。
1.3数据处理
采用Excel 2019软件进行数据统计，采用IBM SPSS Statistics 27软件进行显著性分析。
2结果与分析
2.1形态学观察
在ISP3培养基上，放线菌R2A-77单菌落形态呈圆形，气生菌丝生长繁茂，产生密集孢子堆，菌落呈现灰棕色。通过扫描电镜观察可知，菌株菌丝众多，孢子链伸展，形状为长圆形。
放线菌R2A-77菌株在不同鉴定培养基上的生长存在明显差异，其气生菌丝、基内菌丝的生长状况等方面均有差异，在ISP1、ISP2、ISP6、ISP7培养基上产生可溶性黄色色素，在ISP1、ISP3、R2A、MS培养基上生长旺盛。
相较于其他培养基，放线菌R2A-77菌株在MS培养基上的生长状况较好，菌落颜色为灰白色，形状为圆形，菌落易挑起，气生菌丝呈灰白色，基内菌丝呈乳黄色，无可溶性色素。因此，确定放线菌R2A-77菌株的最适生长培养基为MS培养基。
2.2生理生化特征
放线菌R2A-77菌株在37℃时生长状态最佳，低于19℃和高于40℃时菌株停止生长。NaCl的浓度为0%时，生长状态最佳，培养4 d便有大量孢子覆盖于菌落表面，形成表面干燥、凸起、灰白色的圆形菌落；NaCl浓度为0%~1%时菌株生长，2%时完全停止生长。菌株在pH为5.0~12.0时均能生长，且pH为5.0时菌落较大，产孢子丰富，生长状况最佳。
放线菌R2A-77菌株可使明胶液化，可产过氧化氢酶，但无法使牛奶凝固或胨化，同时也不产硫化氢和黑色素。
2.3 16S rRNA基因测序结果
通过序列测定，放线菌R2A-77菌株的16S rRNA基因长度为1446 bp，且完整性为99.8%。通过EzBioCloud平台对放线菌R2A-77菌株进行16S rRNA基因序列比对，与该菌株高度同源的菌株均来自链霉菌属（Streptomyces）。其中，与放线菌R2A-77最相似的菌株为S.salinarius SS06011，相似度为99.93%，其GenBank登录号为LC430995。
基于16S rRNA基因序列建立系统发育树中，经过1000次聚类，菌株与S.salinarius SS06011进化关系最近。经形态学观察、生理生化特征检测，结合16S rRNA序列测序与系统进化分析，确定放线菌R2A-77为链霉菌（Streptomyces）。
2.4放线菌R2A-77菌株发酵培养基的优化
2.4.1基础培养基
通过对11种不同的液体培养基发酵液进行抑菌活性测定，结果表明，放线菌R2A-77菌株在不同的发酵培养基中的抑菌活性具有一定差异，在MS培养基中的抑菌活性最优，指状青霉生长圈平均直径为20.54 mm?；诖耍《∕S培养基作为基础培养基。
2.4.2碳源
以MS培养基作为基础培养基，分别采用10种不同碳源进行抑菌活性测定。结果表明，在以玉米面、蔗糖、淀粉为碳源发酵液中，指状青霉生长圈平均直径分别为16.58、16.37、16.79 mm，具有较强的抑菌活性，因此选用玉米面、蔗糖、淀粉作为进一步研究的碳源。
2.4.3氮源
以MS培养基作为基础培养基，分别采用10种不同氮源进行抑菌活性测定。结果表明，以大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨为氮源的发酵液中，指状青霉生长圈平均直径分别为11.20、22.10、24.24 mm，具有较强的抑菌活性，因此选用大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨作为进一步研究的氮源。
2.4.4碳源与氮源组合
根据筛选的氮源和碳源对放线菌R2A-77菌株进行交叉组合发酵培养。结果表明，蔗糖+大豆蛋白胨组合的发酵液表现出最优的抑菌活性，指状青霉生长圈平均直径为10.87 mm；蔗糖+大豆粉组合的抑菌活性次之，指状青霉生长圈平均直径为16.54 mm。因此确定蔗糖与大豆蛋白胨作为放线菌R2A-77菌株发酵的最优氮源、碳源组合。
2.4.5碳源与氮源浓度
基于最优碳源、氮源组合，将碳源和氮源浓度分别设置为10个不同浓度梯度对放线菌R2A-77菌株进行发酵培养。结果表明，碳源浓度为10 g/L时，发酵液的抑菌活性最优，指状青霉的生长圈平均直径为9.07 mm；氮源浓度为35 g/L时，发酵液的抑菌活性最优，指状青霉生长圈平均直径为9.46 mm。因此碳源浓度选用10 g/L，氮源浓度选用35 g/L。