枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长抑制作用研究（三）
2.3光学显微镜下观察JN005菌株胞外抗菌物质影响稻瘟病菌菌丝形态和孢子萌发
在光学显微镜下观察稻瘟病菌菌丝，发现无菌水和PBS缓冲液的对照组稻瘟病菌菌丝生长正常，菌丝呈条状且笔直。加入胞外抗菌物质粗提液的处理组稻瘟病菌菌丝生长异常：稀释100倍胞外抗菌物质粗提液处理的菌丝出现肿胀、变形和扭曲，稀释50倍胞外抗菌物质粗提液处理的菌丝断裂、分节，稀释20倍胞外抗菌物质粗提液处理的菌丝顶端逐渐呈球状膨大，胞外抗菌物质粗提液原液处理的菌丝顶端破裂，原生质发生渗漏。
图4 JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌菌丝生长的影响A为无菌水处理，B为PBS缓冲液处理，C~F为胞外抗菌物质粗提液处理。
表1 JN005菌株胞外抗菌物质粗提液对叶瘟的防效(离体接种)
| 处理 Treatment | 稀释倍数 Dilution ratio | 试验组A Test group A 发病率 Disease incidence/% | 试验组B Test group B 发病率 Disease incidence/% |
|---|---|---|---|
| 清水 Water | 0 | 98.5±0.7 a | 97.8±1.3 a |
| PBS缓冲液 PBS buffer | 0 | 97.0±2.0 a | 99.3±0.7 a |
| 40%稻瘟灵乳油 40% isoprothiolane (EC) | 500 | 30.4±3.0 b | 29.6±2.7 c |
| 75%三环唑可湿性粉剂 75% tricyclazole (WP) | 1500 | 20.0±1.3 c | 23.0±1.5 d |
| 胞外抗菌物质粗提液 Extracellular antimicrobial substances crude extract | 100 | 34.1±3.2 b | 38.5±2.7 b |
在光学显微镜下观察稻瘟病菌孢子，当对照组无菌水和PBS缓冲液处理的稻瘟病菌孢子正常萌发时，胞外抗菌物质粗提液处理的稻瘟病菌孢子发生异常：稀释100倍胞外抗菌物质粗提液处理的孢子能够萌发，芽管伸长，但其附着孢膨大；稀释50倍胞外抗菌物质粗提液处理的孢子萌发受阻，芽管短，其附着孢变大，稀释20倍胞外抗菌物质粗提液处理的孢子一端呈球型胀大，胞外抗菌物质粗提液原液处理的孢子变形，孢子两端呈球型变大。
图5 JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌孢子的影响A为无菌水处理；B为PBS缓冲液处理，C~F为胞外抗菌物质粗提液。
2.4 JN005菌株胞外抗菌物质对叶瘟的防治效果
室内湘晚籼12号稻瘟病离体叶片接种表明，试验组A中，对稻瘟病效果最为显著的是1500倍75%三环唑(WP)稀释液，发病率为20.0%；而100倍胞外抗菌物质稀释液的叶瘟发病率为34.1%，较接近发病率为30.4%的500倍40%稻瘟灵(EC)稀释液。试验组B中，稀释1500倍的75%三环唑(WP)发病率为23.0%，稀释500倍的40%稻瘟灵(EC)发病率为29.6%，稀释100倍的胞外抗菌物质发病率为38.5%，三者差异显著。根据图6，发现先进行胞外抗菌物质粗提液处理后接种的叶片防稻瘟病效果整体高于先接种后进行胞外抗菌物质粗提液处理的效果，说明提前施用JN005菌株胞外抗菌物质粗提液有利于水稻叶片对叶瘟的防治。
图6 JN005菌株胞外抗菌物质对叶瘟的防治效果(离体接种)A为清水处理；B为胞外抗菌物质处理。
表2 JN005菌株胞外抗菌物质粗提液对叶瘟的防效(活体接种)
| 处理 Treatment | 稀释倍数 Dilution ratio | 试验组C Test group C | 试验组D Test group D | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 发病率 Disease incidence/% | 病情指数 Disease index | 防治效果 Control efficicy/% | 发病率 Disease incidence/% | 病情指数 Disease index | 防治效果 Control efficicy/% | ||
| 清水 Water | 0 | 97.8±1.1 a | 82.1±0.9 a | / | 96.7±1.9 a | 80.3±0.9 a | / |
| PBS缓冲液 PBS buffer | 0 | 94.4±1.1 a | 80.3±0.7 a | 2.2±0.9 d | 95.6±2.9 a | 79.3±0.6 a | 1.2±0.5 c |
| 40%稻瘟灵乳油 40% isoprothiolane (EC) | 500 | 35.6±2.9 b | 15.1±0.4 c | 81.7±0.5 b | 37.8±2.9 b | 13.7±0.7 c | 83.0±0.9 a |
| 75%三环唑可湿性粉剂 75% tricyclazole (WP) | 1500 | 25.6±2.9 c | 11.3±0.7 d | 86.3±0.7 a | 27.8±1.1 c | 12.5±0.8 c | 84.4±1.1 a |
| 胞外抗菌物质粗提液 Crude extracts of extracellular antimicrobial substances | 100 | 40.0±3.3 b | 20.3±1.6 b | 75.3±1.8 c | 43.3±3.9 b | 22.9±0.9 b | 71.5±1.1 b |
活体喷雾接种试验表明，虽然100倍胞外抗菌物质稀释液在试验组C中防效为75.3%，试验组D中防效为71.5%，但都比不上1500倍75%三环唑(WP)稀释液和500倍40%稻瘟灵(EC)稀释液。各结果相比，先喷施胞外抗菌物质粗提液后接种的水稻防治叶瘟效果比先接种后喷施胞外抗菌物质粗提液效果好，由此得出JN005菌株胞外抗菌物质粗提液对水稻叶片具有?；ぷ饔?。
图7胞外抗菌物质对叶瘟的防效(活体接种)A为清水处理；B为胞外抗菌物质处理。
3讨论
芽孢杆菌生物防治剂一直在植物病害综合管理中扮演着非常重要的角色。许多学者描述了枯草芽孢杆菌产生几丁质酶、蛋白、脂肽等代谢物质，这些物质具有拮抗立枯丝核菌、灰霉病菌、黑条叶斑病菌等植物病原物生长的潜力。本研究发现，枯草芽孢杆菌JN005能够产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和β-1，3-葡聚糖酶，并且JN005菌株的胞外抗菌物质在平板上对稻瘟病菌有较好的拮抗活性。
在提取JN005菌株胞外抗菌物质的过程中，探究了其物理和化学特性。Wang等报道枯草芽孢杆菌E1R-J的抗菌蛋白EP-2在40℃~100℃下孵育30 min后均可检测到抗苹果树腐烂病菌活性，且拮抗效果仅下降14.9%；同样，本研究的枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质在0℃~100℃范围内抗稻瘟病菌的抑菌直径未有大幅度变化，具有热稳定性。郑小亮等测试枯草芽孢杆菌Zl-2抗菌蛋白酸碱稳定性，结果显示过酸、过碱都会影响抗小麦赤霉病菌效果；而枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质在pH 2~11范围内均表现出对稻瘟病菌有抑菌活性，但对pH为12处理最敏感?；苹愕确⑾挚莶菅挎吒司鶶TO-12脂肽类物质分别与多种蛋白酶混合和紫外线照射其抑菌活性没有明显减弱；反观枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质只有经蛋白酶K处理后才保持其原有的抗菌效果，且紫外照射时间越长抑菌活性有所降低。张晓云等的枯草芽孢杆菌CAB-1蛋白粗提物在4℃条件下储存120 d后抑制番茄灰霉菌活性变化不大，枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质对稻瘟病菌也有相同的性质。
在枯草芽孢杆菌抗菌物质影响植物病原菌孢子萌发和菌丝形态方面，刘燕等报道枯草芽孢杆菌SL13抗菌几丁质酶使得立枯丝核菌菌丝细胞壁解体、原生质外泄、菌丝体破裂；吴艳清等用显微镜观察到枯草芽孢杆菌WL2脂肽粗提物能够抑制致病疫霉孢子萌发；本研究的枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质令稻瘟病菌菌丝和孢子都生长异常，且还能阻碍孢子萌发和附着孢形成，这可能会降低稻瘟病在水稻叶片上发生的几率。
黄娜等的枯草芽孢杆菌胞外粗提蛋白防治苹果炭疽病室内活体试验表明，先蛋白处理后接种试验中，不稀释的胞外蛋白的防效可达100%，在先接种后蛋白处理的试验中，胞外蛋白的防效为55%。对于枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质防治水稻叶瘟而言，不论是离体还是活体接种试验，提前施用胞外抗菌物质能提高防治效果，可见胞外抗菌物质一定程度上影响了叶瘟的发生，起到了?；に疽镀淖饔谩５疚亮楹腿愤蚴嵌钥沟疚敛∽畛Ｓ玫牧街只б┘?，而接种实验中，稀释100倍胞外抗菌物质粗提液效果比较接近40%稻瘟灵(EC)，不如75%三环唑(WP)?？莶菅挎吒司谂┮捣矫嫜芯康檬止惴?，也被美国食品和药物管理局认定为"公认安全"的微生物?？悸堑娇莶菅挎吒司鶭N005胞外抗菌物质的实用性，将其纯化鉴定后的物质作为防治稻瘟病的生物防治剂，应用于农业可持续发展是非常有潜力的。
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