枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长抑制作用研究（二）
1.3 JN005菌株胞外抗菌物质的稳定性
将胞外抗菌物质粗提液分别置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下恒温处理30 min后，冷却至室温，采用平板对峙法检测对稻瘟病菌的抑制活性。
将胞外抗菌物质粗提液分别用1 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠溶液将其pH调至2~12，置于4℃下静置24 h后pH调回中性，采用平板对峙法检测对稻瘟病菌的抑制活性。
在胞外抗菌物质粗提液中分别加入等体积的1 mg/mL木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶K、链蛋白酶，充分混匀后常温下静置1 h，采用平板对峙法检测对稻瘟病菌的抑制活性。
将胞外抗菌物质粗提液置于距离28 W紫外灯光的10 cm处，分别照射15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h，采用平板对峙法检测对稻瘟病菌的抑制活性。
将胞外抗菌物质粗提液置于4℃下保存，每隔10 d进行检测，持续检测120 d，采用平板对峙法检测对稻瘟病菌的抑制活性。
1.4 JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发的影响
将胞外抗菌物质粗提液(浓度为1.54 mg/mL)用无菌水分别稀释20倍、50倍和100倍，采用平板对峙法检测对稻瘟病菌的抑制活性，置于28℃恒温培养箱中培养，在第3天将盖玻片插入稻瘟病菌菌饼和加样孔之间的培养基中，相同条件继续培养，待菌丝长至盖玻片上时取出，制成玻片置于光学显微镜下观察，设胞外抗菌物质粗提液原液、PBS缓冲液和无菌水的处理作对照。
将胞外抗菌物质粗提液(浓度为1.54 mg/mL)用无菌水分别稀释20倍、50倍和100倍，吸取3个浓度的液体各500μL与稻瘟病菌分生孢子悬浮液(1×105个/mL)等量混合均匀，再吸取各混合液分别滴100μL于载玻片上，将载玻片架放于带有浅层无菌水的培养皿中于28℃恒温培养箱中加盖保湿培养，每处理3个重复，设胞外抗菌物质粗提液原液、PBS缓冲液和无菌水的处理作对照，当无菌水处理的对照孢子萌发率达到90%以上时，观察各处理孢子萌发情况。
1.5 JN005菌株胞外抗菌物质对叶瘟的防治
将胞外抗菌物质粗提液(浓度为1.54 mg/mL)用无菌水稀释100倍，40%稻瘟灵(EC)用无菌水稀释500倍，75%三环唑(WP)用无菌水稀释1500倍。湘晚籼12号盆栽种植，于5叶1心时，取添加适量吐温的稻瘟病菌分生孢子液(1×105个/mL)，参照《水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程》进行离体叶片接种，即用昆虫针对离体叶片正面制造3个微创伤点，在微创伤点上接种稻瘟病菌孢子悬浮液。接种后的培养皿置于28℃、相对湿度100%环境下，黑暗处理24 h后，再按光照和黑暗正常周期交替培养，直至水稻叶片发稻瘟病。具体分为A、B两个处理，根据清水对照处理的发病情况，计算发病率。
试验组A：离体叶片分别用胞外抗菌物质稀释液、40%稻瘟灵(EC)稀释液、75%三环唑(WP)稀释液、PBS缓冲液和清水浸湿5 min并晾干，24 h后接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液。试验组B：离体叶片接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液，24 h后分别用胞外抗菌物质稀释液、40%稻瘟灵(EC)稀释液、75%三环唑(WP)稀释液、PBS缓冲液和清水浸湿5 min并晾干。
若病斑仅局限于叶片划伤处，呈褐色点状，病斑中无分生孢子形成，记为未发?。蝗舨“叱仕笮?，中央灰色的崩溃部生有菌丝和分生孢子，崩溃部的外围可能有褐色坏死，最外层是淡黄色的中毒部，形状不规则，边缘呈现出暗绿色记为发病。
发病率(%)=(发病病斑数/调查总病斑数)×100。
将胞外抗菌物质粗提液(浓度为1.54 mg/mL)用无菌水稀释100倍，40%稻瘟灵(EC)用无菌水稀释500倍，75%三环唑(WP)用无菌水稀释1500倍。把长至3叶1心的湘晚籼12号秧苗盆栽移至温室内，取添加适量吐温的稻瘟病菌分生孢子液(1×105个/mL)均匀喷雾在叶片上，置于28℃、相对湿度100%环境下，黑暗处理24 h后，再按光照和黑暗正常周期交替培养，直至叶片发稻瘟病。具体分为C、D两个处理，根据清水对照处理的发病情况，调查发病率和病级，计算病情指数和防治效果。
试验组C：先分别喷施胞外抗菌物质稀释液、40%稻瘟灵(EC)稀释液、75%三环唑(WP)稀释液、PBS缓冲液和清水，24 h后喷施稻瘟病菌分生孢子悬浮液。试验组D：先喷施稻瘟病菌分生孢子悬浮液，24 h后分别喷施胞外抗菌物质稀释液、40%稻瘟灵(EC)稀释液、75%三环唑(WP)稀释液、PBS缓冲液和清水。
依据国际稻瘟病圃IRBN，叶瘟分级标准如下：0级为无?。?级为针头状大小褐点，无产孢中心；2级为稍大的褐点(直径1~2 mm)，多数褐点位于植株下部叶片；3级为圆形稍长的灰色小病斑，多数病斑位于植株上部叶片；4级为典型纺锤形病斑，直径3 mm以上，病斑面积4%；5级为典型病斑，病斑面积4%~10%；6级为典型病斑，病斑面积11%~25%；7级为典型病斑，病斑面积16%~50%；8级为典型病斑，病斑面积51%~75%；9级病斑面积75%以上。
发病率(%)=(发病株数/调查总株数)×100；
病情指数=[∑(各病级植株数×各级代表数值)/调查总植株数×最高级别值]×100；
防治效果(%)=(对照病指-处理病指/对照病指)×100。
1.6数据统计与分析
数据利用Microsoft Excel 2007软件进行图表制作，采用IBM SPSS Statistics 19软件进行差异显著性分析，不同字母表示在0.05水平上差异显著。
2结果与分析
2.1 JN005菌株抑菌物质产酶和产气测定
经检测发现，JN005菌株在胶体几丁质酶培养基和CAS培养基平板上没有形成水解圈，但在脱脂牛奶琼脂培养基、纤维素酶选择性培养基、0.2%可溶性淀粉培养基和β-1，3-葡聚糖酶培养基平板上形成水解圈，因而推测JN005菌株不能分泌几丁质酶和嗜铁素，但能产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和β-1，3-葡聚糖酶。JN005菌株的挥发性气体对稻瘟病菌生长基本无影响，但JN005菌株的胞外抗菌物质粗提液能够有效拮抗稻瘟病菌生长。
图1 JN005菌株产蛋白酶（A）、纤维素酶（B）、淀粉酶（C）和β-1，3-葡聚糖酶（D）的检测
图2 JN005菌株挥发性气体(A)和胞外抗菌物质(B)对稻瘟病菌的影响
2.2 JN005菌株胞外抗菌物质的稳定性
实验结果表明，在0℃~100℃范围内随着温度的升高，JN005菌株胞外抗菌物质粗提液对稻瘟病菌的抑菌直径会减小，但0℃和100℃处理对比，抑菌直径只下降了2.11 mm；JN005菌株胞外抗菌物质粗提液在pH 2~12范围内拮抗稻瘟病菌活性较为稳定，抑菌直径未有大幅度变化，但pH=12处理最影响其活性；当胞外抗菌物质粗提液与蛋白酶K混合孵育后，抑菌直径保持稳定，未有活性损失，而木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和链蛋白酶则不同程度地降低了抑菌直径；胞外抗菌物质粗提液在紫外下照射时间越长抑菌直径随之下降，但照射12 h后依旧保持活性；胞外抗菌物质粗提液在4℃下保存3个月以上仍然对稻瘟病菌生长具有拮抗作用，但随着时间的推移抑菌直径逐渐减小。
图3不同处理对JN005菌株胞外抗菌物质抑制稻瘟病菌菌丝生长稳定性的影响
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