基于生长速率法评估植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌抑制效果（一）
摘要
摘要：采用生长速率法测定植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌菌丝生长的影响，并对抑菌活性物质的理化性质进行了研究。结果表明，该菌的发酵液对甜瓜疫霉菌菌丝的生长有抑制作用。发酵液中的活性物质有较好的热稳定性，在pH6.0时抑菌效果较好，对酸性蛋白酶敏感，对中性蛋白酶不敏感，常温下10d的稳定性较好。通过调节pH、酶处理和加热处理实验，说明其抑菌活性物质不是乳酸，蛋白质类物质起了一定的抑菌作用，但其抑菌现象可能是与其他物质共同作用的结果。
引言
疫霉菌是疫霉属(Phytophthora)真菌的统称，隶属鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉目腐霉科疫霉菌。疫霉菌大多存活于土壤，潜育期短，传播速度快，侵染力强，对植物破坏性大。病菌侵入寄主植物后在很短的时间内产生大量的孢子囊并释放游动孢子，成为再侵染源，使该病害难以控制，经常给农业生产造成巨大损失。
目前对植物卵菌病害依靠化学防治，常用杀菌剂如瑞毒霉、杀毒矾、甲霜灵等药物。这些药剂价格昂贵，长期大量施用对人和环境造成极大危害，因此开发环保、高效的生物农药具有重要意义。
利用有益微生物制约有害微生物，是开发和利用微生物资源的重要研究领域之一，在植物病害防治中最具潜力，应用前景最为广阔。
目前已有不少以活体微生物或其代谢产物控制致病疫霉菌及其危害为目的的研究。Fachouri等从P.fluorescens菌株G308中分离出一种新的抗生素N-mercapto-4-formylcar-bostyril(Cbs)，可在体外抑制马铃薯晚疫病的孢子萌发及菌丝体生长；王艳红等从土壤中筛选出一株放线菌WL70，其代谢产物可抑制番茄早疫病菌。这些研究表明，从微生物代谢产物中分离抗植物致病菌的生物活性成分用于生物农药开发是很有可能的。
乳酸菌是能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。目前有关乳酸菌抑菌的报道甚多，但这些报道多集中于对细菌的抑制作用，其产生的抑菌物质主要有有机酸、过氧化氢以及细菌素等。
近年来的研究表明，某些乳酸杆菌可抑制霉菌的生长和产毒。
唐雨蕊等从牛粪中分离出一株乳酸杆菌BN3，它能明显地抑制黄曲霉的生长，并且对黄曲霉的孢子萌发有抑制作用。本文对植物乳杆菌Bx6-2发酵液中活性代谢产物的抑制疫霉作用及理化性质进行了研究，为乳酸菌在生物农药方面的应用提供实验依据。
1材料及方法
1.1菌株
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Bx6-2由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室从酸马奶中分离得到。甜瓜疫霉菌(Phytophthora.drechsleri Tucker)由天津市植物保护研究所提供。
1.2培养基
V8培养基：V8汁20mL，琼脂1.5 g，CaCO?0.3 g，蒸馏水80 mL。
MRS培养基：蛋白胨胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，吐温80 1 mL，柠檬酸三铵2 g，K?HPO?2 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，MgSO?·7H?O 0.1 g，MnSO?·4H?O 0.05 g，蒸馏水1000mL，pH 6.5。
燕麦培养基：50 g燕麦片加到1000 mL蒸馏水中，在60°C恒温水浴锅中加热1h，经4层纱布过滤去渣，加蒸馏水稀释到1000 mL，再加入琼脂18 g。
PDA培养基：200 g去皮土豆切块，加入1000 mL蒸馏水，煮沸30 min后2层纱布过滤去渣，加入葡萄糖20 g、琼脂20 g，稀释到1000 mL。
上述培养基均在121°C灭菌20 min。
1.3植物乳杆菌培养液的制备
将保存的植物乳杆菌Bx6-2接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，按1%接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37°C厌氧培养48h。将其发酵液以3000 r/min离心20 min，取上清液备用。
1.4不同培养基对甜瓜疫霉菌
将甜瓜疫霉菌接种于V8培养基平板上，25°C培养4 d。用打孔器在菌落边缘处打取直径5mm的菌块，将菌块分别放在燕麦培养基、PDA培养基、V8培养基平板的中央，25°C培养4 d后测量各菌落直径，比较不同培养基对甜瓜疫霉菌菌丝生长的影响，确定其生长的最适培养基。
1.5植物乳杆菌发酵液对菌丝生长的抑制作用
植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌抑菌活性的测定参照黄雄英等采用的生长速率法，并对该方法进行了适当的改进。将植物乳杆菌Bx6-2的上清液以体积分数为0.5%、1%、2%、4%和8%加入到20 mL的V8培养基中，再分别倒入90 mm直径的灭菌培养皿内制成平板；以不加发酵液的培养基为对照。用打孔器在菌落边缘处打取直径5mm的菌块，放置在平板中央，25°C培养4 d，测量菌落直径(d)，按公式(1)计算抑菌率。
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