特定精油可有效根除铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜（二）
其他抗菌精油在杀死铜绿假单胞菌生物膜方面的效果是否与肉桂油一样？为了回答这个问题，我们根据临床实验室和标准研究所的协议使用MHB琼脂在盘扩散试验中筛选了可以杀死铜绿假单胞菌PAO1的精油。这些精油由Aura Cacia和New Directions Aromatics提供，并被描述为100%纯度。每种精油的20微升未经稀释地点在由3层Whatman滤纸制成的滤纸盘上。我们的数据表明，以下精油在杀死铜绿假单胞菌方面有效：肉桂、丁香（Syzygium aromaticum）、秘鲁香膏（Myroxylon balsamum），红迷迭香（Thymus vulgaris）和茶树（Melaleuca alternifolia）精油（图2）。为了考虑这些精油可能穿透琼脂的程度不同，导致看似抗菌效果降低的可能性，任何产生可见抑制区的精油都被考虑用于后续实验。
图2扩散试验鉴定出具有抗菌活性的精油。抗生素浓度为20 mg ml?1(A)和纯精油(B)被测试对铜绿假单胞菌PAO1。产生抑制区的物质进一步分析；薰衣草油作为阴性对照。
在下一步中，我们探讨了在盘扩散试验中表现出活性的油是否在杀死生物膜方面也有效。为了研究这一点，我们确定了每种油的两个参数：杀死悬浮细胞所需的最低抑制浓度（MIC）和最小生物膜消除浓度（MBEC）。生物膜是在MBEC装置（Innovotech Inc.，加拿大埃德蒙顿）上生长的，这是一个经过修改的微孔板，盖子上附有96个聚苯乙烯钉。钉子浸泡在含有10的MHB培养基中?个细胞/ml，37°C和30°C振荡培养P.aeruginosa PAO1和P.putida KT2440，分别。24小时后，长在钉子上的生物膜被冲洗，并按照图3所示，在阳离子调整的MHB中进行1:1的抗生素和精油的系列稀释；稀释精油的培养基中补充了0.1%的吐温。挑战培养基的体积为200μl，测试的抗生素和精油的最高浓度为100μg ml?1和5%，分别。青霉素和薰衣草分别作为抗生素和精油的阴性对照。经过2小时的培养后，将peg洗涤，浸入150μl新鲜的MHB中，并在Branson 2510超声波发生器（40 kHz）中超声10分钟，以释放和解离与peg相关的生物膜。通过将peg从盖子上折断并分别在含有200μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）的微量离心管中超声来确定每个peg上的平均细胞数。将所得溶液进行系列稀释并接种，以确定CFU。CFU计数显示，每个peg上的平均细胞数为3×10?个PAO1和4×10?个。对于KT2440。为了获得MIC，每孔加入相同数量的planktonic细胞，以抗生素或精油进行挑战。2小时后，每孔加入20μl到新鲜的MHB中。经过过夜培养后，确定每种化学物质最低的浓度，以防止生物膜和planktonic细胞的存活。实验重复三次，确定平均MIC或MBEC。
图3选定抗生素和抗菌精油对铜绿假单胞菌PAO1(A,B)和粘细菌KT2440(C)的活性。通过挑战细菌（无论是游离状态还是在生物膜内）来确定各种物质的MIC和MBEC。星号表示数据超出了图表的范围，表明在测试浓度下没有观察到杀伤作用。每个实验都进行了三次重复，误差棒表示标准误差。
图3A和B显示了每种测试物质的MIC和MBEC。只有单一的抗生素，氧氟沙星，能够以几乎相同的效果根除planktonic和生物膜细菌。其他抗生素，多粘菌素和gentamicin，在浓度比MIC高10倍的情况下，仍然无法有效杀死生物膜。相比之下，卡西和秘鲁香膏的精油在几乎相同的浓度下对生物膜和planktonic细菌有效。这一观察结果确认了图1的结果。对于肉桂油，观察到MIC和MBEC差异很小。有趣的是，红迷迭香油在浓度约为2%时对生物膜有效，但在任何测试浓度下都无法杀死游离细胞。这表明迷迭香油对生物膜的效力比对溶液中细菌的效力更高。为了确定统计显著性，我们进行了单样本t检验，将生物膜种群与游离细胞种群的平均值进行比较。由于红迷迭香的游离细胞种群在最高测试浓度下未被杀死，我们使用最大值（5%）作为种群平均值，以查看在该水平上是否可以检测到显著性。确实，PAO1和KT2440的游离细胞和生物膜种群之间的差异具有显著性(P<0.05)，表明红迷迭香油对生物膜的抑制效果比对游离细胞的效果更好。我们得出结论，这里测试的精油对生物膜的抑制效果比测试的抗生素更好。
为了测试精油对潜在菌株特异性的影响，我们评估了它们对邻近菌株（KT2440）的影响（图3C）。我们的数据表明邻近菌株比铜绿假单胞菌对丁香、红百里香和茶树油更敏感（图3）。这种效果在丁香油上尤为明显，丁香油没有消除PAO1，但对KT2440生物膜和悬浮细胞有很强的抑制作用（图3）。使用单一样本t检验比较邻近菌株和铜绿假单胞菌的丁香油数据（假设铜绿假单胞菌样本为5%），我们发现丁香油对假单胞菌的影响与对铜绿假单胞菌的影响显著不同（P<0.05）。此外，红百里香油在5%的浓度下对游离细菌有效，这是测试的最高浓度，而茶树油对生物膜细胞有效。由于铜绿假单胞菌在测试的最高浓度下仍然存活，我们无法计算这些情况下的统计显著性。两种假单胞菌这些菌株表明了这些精油对特定物种的活性，并表明可能有特定的抗性机制在起作用。例如，由于某些精油似乎作用于细胞壁或细胞膜，因此这些细胞成分的组成可能是决定对精油敏感性的重要因素。这些精油对特定物种的活性表明，针对不同微生物的定制组合可能对多物种生物膜有效。
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