脂肽对蜜蜂球囊菌生长抑制作用及其孢子萌发的影响（一）
摘要
目的:探究脂肽对蜜蜂球囊菌的抑制作用和机制，以及其体外抑菌和杀菌活性。方法:通过形态学和分子生物学等方法鉴定蜜蜂球囊菌，采用抑菌圈试验法验证脂肽能否抑制蜜蜂球囊菌生长，采用倍比稀释法测定脂肽对蜜蜂球囊菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)。采用BioSense微生物快速立体计数仪观察脂肽对蜜蜂球囊菌孢子萌发的影响;高效液相色谱法测定蜜蜂球囊菌细胞膜中麦角甾甾醇和细胞壁中几丁质含量，确定脂肽Iturin对蜜蜂球囊菌是否存在抑制作用。
结果:显微镜观察发现，分离菌菌丝呈有隔膜的分枝状和具有球形的孢子囊、孢子等形态。18S rDNA测序结果显示，分离菌与蜜蜂球囊菌(GenBank登录号:GQ867785.1)序列相似性为100%，确定获得的菌株为蜜蜂球囊菌。脂肽伊枯草菌素(Iturin)对蜜蜂球囊菌的抑制作用最好，抑菌圈半径达8.53mm，丰原素(Fengycin)抑菌圈半径为5.84mm，表面活性素(Surfactin)无抑制作用。Iturin对蜜蜂球囊菌的MIC为6.25~25μg/mL,MIC??、MIC??和MFC分别为6.25、25和50μg/mL。与0μg/mL Iturin处理组相比，6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin处理组蜜蜂球囊菌孢子萌发率均显著下降(P<0.05)。麦角甾甾醇含量测定结果显示，与0μg/mL Iturin处理组相比，12.5、25和50μg/mL Iturin处理组蜜蜂球囊菌细胞膜麦角甾甾醇含量均显著下降(P<0.05)。几丁质含量测定结果显示，与0μg/mL Iturin处理组相比，25和50μg/mL Iturin处理组蜜蜂球囊菌细胞壁几丁质含量显著下降(P<0.05)。结论:脂肽Iturin通过减少孢子萌发，破坏细胞膜中麦角甾甾醇的生物合成及损害细胞壁中几丁质的合成来有效抑制蜜蜂球囊菌。
1材料与方法
1.1材料
?菌株:蜜蜂球囊菌源自患白垩垩病蜜蜂幼虫，经纯化培养所得，患病蜜蜂幼虫由中国农业科学院蜜蜂研究所提供。
?主要试剂和仪器:Surfactin、PI染液均购自上海源叶生物科技有限公司;Fengycin购自南京翼飞雪生物科技有限公司;Iturin购自上海皓元生物医药科技有限公司;麦角甾甾醇标准品购自北京百灵威科技有限公司;甲壳素标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐购自上海麦克林生化科技有限公司;氯甲酸-9-芴基、甲酯(FMOC-CL)均购自北京华威锐科化工有限公司;真菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)购自北京奥博星生物科技有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。硼酸钠溶液配制:称一定量的硼酸，用NaOH将pH调至中性，并使其浓度为0.2mol/L。脂肽溶液的配制:将脂肽Surfactin、Fengycin、Iturin分别溶于甲醇溶液中使其浓度为1mg/mL，备用。
生化培养箱购自上海精宏实验设备有限公司;生物安全柜购自NuAire公司;PCR仪购自杭州博日科技有限公司;凝胶成像分析仪购自杭州米欧仪器有限公司;液相色谱仪购自安捷伦科技有限公司;激光共聚焦显微镜和体式显微镜均购自徕卡公司;BioSense微生物快速立体计数仪购自丹麦BioSense公司;光学显微镜购自OLYMPUS公司;灭菌锅、电子天平、烘干箱、离心机、测微尺。
1.2方法
1.2.1分离菌形态学鉴定
分离菌显微观察及测量:将纯化菌株产生的黑色子实体和白色菌丝分别置于载玻片上并滴一滴无菌水，混合均匀，盖上盖玻片，在体式显微镜下进行观察，在普通光学显微镜下用测微尺测量其大小，取4组球囊菌，每组重复测定3次。
1.2.2分离菌分子生物学鉴定
用真菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌DNA，设计真菌通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',PCR扩增18S rDNA，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系和反应程序参照戚伟等方法。PCR反应体系50μL:2xTaq Master Mix(Dye)25μL,模板DNA 1μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,ddH?O 20μL。PCR反应程序:98℃预变性2min;98℃变性10s,54℃退火70s,72℃延伸10s,共35个循环;72℃延伸5 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果,并将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
相关新闻推荐
1、平湖红曲黄酒酿造过程中真菌菌群动态、红曲霉生长抑制因素（二）
2、鸭瘟病毒基因缺失株rDEV-ΔVP26生长曲线、蚀斑面积及免疫原性分析（三）