基于生长速率法优化放线菌发酵培养基和发酵条件（一）
摘要
柑橘是我国优势水果产业，对推动乡村振兴具有重要意义。但柑橘表面存在许多自然孔口，在采后贮藏和运输过程中极易受到病原菌的侵染而发生病害。其中，柑橘绿霉病是由指状青霉（Penicillium digitatum）侵染而成，发病过程快，传染性强，造成果实采收后品质严重下降，给柑橘产业带来巨大的经济损失。本团队以柑橘绿霉病病原菌为靶标菌，从广东省湛江市廉江九洲江红橙园红橙植株的根部土壤中分离筛选出1株对柑橘绿霉病病原菌具有良好拮抗作用的放线菌R2A-77，对菌株进行形态学观察、生理生化特征和分子生物学鉴定，采用生长速率法对靶标菌生长圈直径判断发酵液的抑菌活性，采用单因素和交叉组合试验优化菌株发酵条件，以提高发酵液抑菌活性。
结果表明：放线菌R2A-77初步鉴定为链霉菌属（Streptomyces）；最优发酵培养基为蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨35 g/L、蒸馏水1000 mL；最优发酵条件为发酵初始pH 7.0、发酵时间为6 d、接种量为3%、装液量为150 mL/250 mL；放线菌R2A-77发酵条件优化后，其发酵液的抑菌活性比优化前提高15%，抑菌率为98%。结果说明，放线菌R2A-77对指状青霉具有较好的拮抗效果，有较好的实际应用前景，该研究结果为绿色防控柑橘绿霉病积累了资源，为后期规?；⒔鸵约吧谰恋目⒌於ɑ?。
放线菌是一类极具开发潜力的生物资源，在空气、土壤以及水体中均可生存，且具有生长速度快和代谢产物多等特点，已被广泛应用于食品、药品和农业等领域。目前，利用生防放线菌与病原菌的竞争关系或拮抗作用来控制病害已成为研究热点。已有研究表明，放线菌发酵液对辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、山茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）等植物病原菌具有良好的抑菌活性。在公众对食品安全关注度持续攀升的当下，利用生物手段防治农作物病害，已成为农业微生物领域的关键研究课题。
指状青霉（Penicillium digitatum）是一种坏死营养型的病原真菌，可通过果实表面的损伤入侵果实内部组织，导致宿主细胞死亡，进而利用营养进行生长。柑橘在田间生长、采收及贮藏运输过程中极易受到物理损伤而产生伤口，这为病原微生物的入侵创造了条件，最终导致果实腐烂，造成严重的经济损失。长期以来，国内外对水果病害的防治主要依赖化学杀菌剂，但长期使用化学杀菌剂不仅会导致病原菌产生耐药性而降低防治效果，还会严重危害人体健康和环境。而生物防治法采用具有安全性、有效性、环保性和高经济效益优势的拮抗微生物，可实现农业的安全生产。NAJMEH等从农田土壤中分离出的110株链霉菌菌株对指状青霉具有良好的抑制作用。林书华等揭示了链霉菌X33发酵提取物（SLFE）对柑橘绿霉病菌具有防治效果。本团队从广东省湛江市廉江九洲江红橙园红橙植株根部土壤中分离筛选出1株对指状青霉具有较好拮抗活性的放线菌R2A-77，本研究对该菌株进行鉴定以及发酵条件优化，为廉江红橙土壤微生物资源及活性物质的开发奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株和病原真菌
从广东省湛江市廉江九洲江红橙园红橙植株根部土壤分离筛选出放线菌R2A-77。指状青霉由西南大学食品科学学院曾凯芳教授惠赠。
1.1.2培养基
菌株鉴定固体培养基：ISP系列培养基（ISP1~ISP7）、PDA培养基、R2A培养基、GA培养基、改良G2培养基、MS培养基、NA培养基、黑色素培养基、硫化氢培养基、明胶液化培养基、牛奶凝固与胨化培养基。
菌株液体发酵培养基：ISP系列培养基（ISP1~ISP7）、PDA培养基、GA培养基、改良G2培养基、MS培养基。
生长培养基：改良G2培养基。
1.2方法
1.2.1菌株鉴定
（1）形态学观察。将菌株划线接种至ISP3固体培养基，28℃条件培养5 d，用扫描电镜观察菌丝特征及孢子形态。
采用固体培养基划线接种菌株，在28℃下培养10 d。在第3、5、7、10天采用平皿插片法和光学显微镜观察菌株菌体形态，筛选出菌株最优生长培养基作为基础培养基。
（2）生理生化特征测定。参考文献中的方法对菌株的生理生化特性进行测定。测定内容包括：最适温度、最适盐浓度、最适培育pH、过氧化氢酶的产生、黑色素/硫化氢的产生、明胶液化、牛奶凝固或胨化。
（3）16S rRNA基因序列测定与分析。将菌株送至北京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA基因序列测定。测序结果与EzBioCloud数据库进行比对，筛选相似菌株。采用MEGA 11软件进行邻接法（Neighbor-Joining，NJ）系统发育分析，设置1000次bootstrap评估拓扑结构，构建16S rRNA基因的系统发育树，确定菌株的种属。
1.2.2菌株抑菌能力测定
（1）菌种活化和制备种子液。菌种活化：将菌种接种至改良G2固体培养基中，于28℃培养5 d。
制备种子液：将菌株接种至150 mL/250 mL的改良G2液体培养基中，于28℃、180 r/min摇床培养3 d。
（2）制备菌株无菌发酵液。将3%的种子液加入到150 mL/250 mL发酵培养基中，于28℃、180 r/min培养5 d。取发酵上清液，于10 000 r/min离心15 min，用0.22μm微孔滤膜过滤后得到无菌发酵滤液。
（3）发酵液抑菌活性测定。采用生长速率法测定菌株发酵液对靶标菌的抑菌活性。发酵液与PDA培养基按1∶10（V/V）制成平板。将8 mm靶标菌菌饼置于平板中央，于28℃培养5 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算平均值和抑菌率。抑菌率=[(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/(对照病原菌菌落直径-菌饼直径)]×100%。
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