梅花鹿体细胞航天诱变、细胞样品回收培养技术、生长曲线及核型特性（三）
2结果与分析
2.1航天诱变梅花鹿体细胞的回收与体外培养
由于航天诱变条件下的动物体细胞培养还没有成熟的方法，本次实验采用自主研发的PVDF膜培养法，梅花鹿体细胞样品在太空飞行12 d后成功回收建系。其细胞经过航天诱变处理后生长状态良好，基本保持成纤维细胞特性（图2）?；厥蘸蟮奶逑赴さ?0%汇合度后，其中一部分用于传代培养，其余全部进行冷冻保存。
2.2航天诱变组梅花鹿体细胞的生长曲线分析
根据3次实验重复数据平均值得到的航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞的生长曲线，总体均呈“S”型生长趋势，对照组梅花鹿体细胞经培养2 d后进入对数生长期，航天诱变组梅花鹿体细胞经培养4 d后进入对数生长期。两个体细胞系的细胞都在培养7 d后出现生长速度减慢的现象。由此得出航天诱变的梅花鹿体细胞能够在体外培养生长正常。通过3次实验重复结果来看，每个细胞系生长曲线分析结果稳定（图3）。
2.3航天诱变组和对照组雌性梅花鹿体细胞的拟合生长曲线分析
Logistic曲线模型能很好地拟合3组航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞的生长曲线（表1），拟合度（R2）均接近1，说明其生长曲线的拟合度很好。拐点时间是细胞量增加速度由快到慢的转折点，梅花鹿航天诱变组体细胞的拐点时间大于对照组拐点时间，即对照组梅花鹿体细胞早于航天诱变组样品到达生长拐点。而从拐点细胞量来看，梅花鹿体细胞对照组的生长速度大于航天诱变组。
2.4航天诱变梅花鹿体细胞的核型
航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞的细胞中期分裂相分析结果显示，染色体数目2n为66的分裂相分别占90%和94%。利用细胞遗传工作站（AI）软件根据其染色体的形态结构对染色体序列进行排列。实验观察记录了各100个航天诱变和对照组的梅花鹿体细胞染色体的形态，选择分散良好且形态较好的中期分裂相进行显微摄影、放大、比对、排列（图4）。梅花鹿染色体核型（karyotype）2n=66，其中，32对常染色体，1对性染色体，X染色体为最大的染色体。其中航天诱变的梅花鹿体细胞未出现异常，且染色体形态正常。
3讨论
3.1梅花鹿体细胞的航天诱变及细胞样品回收培养技术
动物体细胞的正常培养条件是用液体培养基，其基础营养成分中需要进一步添加血清并控制95%空气和5%CO?的气相条件，同时需要保持细胞渗透压（osmotic pressure）在260~320 mOsm/kg（mOsm为milliosmol的缩写，即毫渗量，是渗透压的单位，1 mOsm/kg=2.575 kPa）和pH 7.2左右的酸碱度（power of hydrogen）。但是航天实验从安全角度考虑，载物舱内不能使用液体培养基，也没有正常细胞培养的气相控制条件，同时还伴有短时（10~20 min）高温冲击（温度高于40℃），这些都是航天条件下进行动物细胞培养所面临的主要问题?；谝陨锨榭鑫颐茄兄屏薖VDF膜培养基技术，基本保证细胞生长所需营养、pH和渗透压等基本条件。实验结果显示，利用自主研发的PVDF膜动物细胞培养法，可以使鹿体细胞样品在太空舱内飞行12 d后，保持细胞活力并成功回收建系。其细胞经过航天诱变处理后生长状态良好，基本保持成纤维细胞特性。这种动物体细胞太空培养方法的开发为以后进行相关实验提供了基础技术支撑。
3.2生长曲线及拟合生长特点
本实验采用台盼蓝染色直接计数法测定航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞的生长曲线。实验步骤中最关键的是，确定所有组接种的细胞量要一致，即每孔接种细胞量为1×10?；向血球计数板中加入培养液时要匀速缓慢；确保计数准确，从而避免不必要的人为因素导致实验结果不可信。通过3次重复的生长曲线测定实验结果表明，本实验的细胞计数板法计数结果稳定性较好。Logistic模型参数在航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞间存在差异，其中代表极限细胞量的A值有较小差异，这说明航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞有差异；Logistic模型中B值（代表达到最大生长速率的参数）也存在差异，即航天诱变组梅花鹿体细胞最大生长速率出现得较对照组梅花鹿体细胞迟。航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞生长速率参数差异很小。实验数据结果证明了对照组体细胞的生长速度大于航天诱变组生长速度。虽然航天诱变组体细胞生长速度不如对照组生长速度快，但其生长特性正常且良好。拟合生长曲线分析表明，与对照组相比航天诱变组细胞生长拟合度值相似，但细胞增殖拐点时间、拐点细胞量分析结果证明，航天诱变后的体细胞增殖速度减慢。增殖速度减慢有极大可能与细胞生长周期相关基因的表达有关。近几年来，很多科研工作将较多的精力致力于细胞骨架系统中不同因素对细胞骨架分子聚合、解聚组装的影响、细胞骨架调节的信号传导途径和基因表达研究。同时也有结果表明，重力可直接影响微管分子自组装过程；微重力或模拟失重引起的细胞外基质或整合素表达变化可影响ERK信号传导途径。因此后期实验将以航天诱变处理的梅花鹿体细胞回收后生长速度减慢为依据，筛选出与细胞生长周期相关基因CCNE1、CDC34、CDK6、CKS2及ABL1，比较它们在对照组和航天诱变组梅花鹿体细胞中的表达量，从而为进一步了解航天诱变对梅花鹿体细胞影响提供理论依据。
3.3航天诱变梅花鹿体细胞核型
本实验采用低渗滴片法制备染色体标本。实验步骤中最关键的是，控制适宜的低渗时间，低渗时间过长导致细胞破裂，低渗时间不够使得染色体铺展不好；另外将玻片提前20~30 min放入?20℃的冰箱中，使用前5 min放入4℃冰柜中，确保在滴片时玻片上有一层水膜，也可提高中期分裂相的分散程度并得到理想的核型分析图。本研究获得了大量清晰的梅花鹿体细胞中期染色体相，观察结果表明，航天诱变并没有导致梅花鹿体细胞染色体形态和数量的变化，也没有引起梅花鹿体细胞在细胞水平的遗传学变化。由此推断航天诱变过程中微重力（microgravity）、太空电磁波、太空辐射等与地球表面不同的物理条件可能导致梅花鹿体细胞在基因水平或基因表达水平上的某些变化。有关这一方面的研究，下一步我们将通过基因组和转录组测序技术进一步研究其中的原因。
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