贝氏柯克斯体在高渗脱水环境中的生物学特性研究（三）
2.3高渗压脱水的贝氏柯克斯体感染性VFU值的对比测定
研究表明,环境野生型与实验室培养的贝氏柯克斯体对真核细胞的感染性不同,基于无生命培养基高渗压脱水后的菌体对真核细胞的感染性未知。因此,我们通过qPCR定量并调整NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl菌体拷贝一致后,利用相差显微镜计数高渗脱水所得菌体NMII10×NaCl感染BGMK细胞的VFU值,可见在感染后24 h高渗透压组菌体NMII10×NaCl的VFU较常规组NMII、低渗透压组NMII1/100×NaCl的VFU无显著改变。在感染后96 h,NMII10×NaCl的VFU对比感染后24 h未见明显对数增长,这与NMII及NMII1/100×NaCl在感染后96 h VFU的对数增长显著不同。值得注意的是,在感染后144 h,NMII10×NaCl的VFU对比感染后96 h的VFU值增加,同时与NMII有统计学差异(t=-2.11,P<0.05),这提示可能与菌体经高渗脱水处理后在胞内的适应性生长有关,如图3所示。
图3渗透压梯度培养后的贝氏柯克斯体感染BGMK细胞的VFU值
2.4透射电子显微镜对比分析贝氏柯克斯体菌体形态
在自然环境中,贝氏柯克斯体以耐干燥脱水且具备感染性的I相菌体广泛存在,形态类似于双相发育周期中直径小于1μm的小贝氏体(SCVs)。然而在实验室研究中,典型双相发育周期中的大贝氏体(LCVs)直径多大于0.5μm。使用透射电子显微镜观察贝氏柯克斯体NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl在无生命培养环境中的形态学变化,可见脱水条件下,菌体成簇生长,直径大多小于1μm,菌体类似脱水皱缩的表面结构。在低渗压组中,菌体直径大多1μm以上,形态类似于表面饱满的球杆状,对比可见NMII直径约为1μm的典型菌体结构。进一步分别将NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl感染BGMK细胞后培养7 d,使用透射电镜观察可见3组菌体均可感染并在胞质内形成CCV囊泡,且囊泡直径无明显差别,同时菌体在CCV囊泡内呈典型的双相发育菌体形态。这提示与无细胞培养体系中的发育周期不同,菌体在胞内的繁殖环境有利于菌体的典型双相发育,如图4所示。
图4贝氏柯克斯体形态的电子显微镜对比分析
注:A、D为NMII10×NaCl;B、E为NM;C、F为NMII1/100×NaCl,均为培养后第7 d。
3讨论
贝氏柯克斯体作为一种经气溶胶传播的烈性传染病原体,具有极强的感染能力与环境抵抗力。一直以来,由于该病原自身的胞内寄生繁殖特性以及缺乏无生命克隆纯化技术,关于贝氏柯克斯体的环境耐受性机制研究进展缓慢。近年来,无生命培养方法的研制不仅部分解决了贝氏柯克斯体克隆纯化的难题,而且为该菌的基因编辑提供了技术支撑,同时ACCM培养基组分的可量化调整有助于实验室模拟外界脱水条件,从而进一步探究贝氏柯克斯体的环境抵抗特性遗传机制。
脱水是细菌失活的主要方式之一,本研究以无生命培养系统为技术平台,成功建立了渗透压梯度的贝氏柯克斯体脱水研究模型,为后续探究菌体耐脱水相关蛋白表达以及对应基因转录水平打下了基础。我们通过研究发现贝氏柯克斯体NMII可在高达3 500 mOsm/L渗透压脱水的无生命培养基中适应性存活,而在低渗透压条件下可获得有限生长,这不仅说明菌体可在无生命环境中抵抗脱水,也验证了Na+与Cl-是无生命培养体系中实现指数增长的重要组分。另外在细胞感染及生长特性方面,在感染后96 h,经脱水后NMII10×NaCl的VFU显著低于NMII,而低渗透压培养的NMII1/100×NaCl与NMII在感染后96 h的VFU差别无统计学意义,但在感染后144 h,经高渗脱水后NMII10×NaCl的VFU仍较前增加,仅与NMII有统计学差异(t=-2.11,P<0.05)。这提示脱水处理后的菌体感染BGMK细胞后的适应性生长过程可能较野生型延长,同时提示上述感染及适应性生长特性改变可能与菌体生长环境中的渗透压变化所致自身相关蛋白表达水平有关,结合菌体在透射电子显微镜下的形态变化,这提示这些蛋白的表达水平变化很可能影响菌体的双相发育。
贝氏柯克斯体自然野生株的获取及克隆制备是本领域的技术难题,一直以来缺乏实验室研究模型,本研究成功培养制备了脱水存活的贝氏柯克斯体菌株,为进一步在蛋白质组及基因水平分析该病原耐受脱水的遗传机制奠定了实验性基础。
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