鸭瘟病毒基因缺失株rDEV-ΔVP26生长曲线、蚀斑面积及免疫原性分析（二）
1.5重组病毒的拯救
参照磷酸钙转染方法将pDEV-ΔVP26转染至CEFs，待其出现荧光且荧光斑达到90%后收获病毒，命名为rDEV-ΔVP26。
1.6重组病毒生长曲线
将CEFs传代于12孔板上，次日分别用0.01 MOI(multiplicity of infection)的rDEV-EF1和rDEV-ΔVP26感染CEFs，2 h后加入含有2%FBS的DMEM，重复3孔后置于37℃CO2培养箱培养。分别于感染后12、24、36、48、60、72、84、96 h收集3孔细胞和上清混合后研磨，分装，置于-80℃保存。采用Reed-Muench法在含有CEFs的96孔板测定各个时间点的TCID50，并绘制出重组病毒的生长曲线。
1.7重组病毒蚀斑面积
将rDEV-EF1和rDEV-ΔVP26病毒冻存液用不同稀释度进行稀释，接种于12孔板中的单层CEFs上，2 h后，换上含有1.5%甲基纤维素的DMEM培养基，置于37℃CO2培养箱培养48 h。在荧光显微镜下各拍摄100个荧光蚀斑，采用Image J软件测量蚀斑面积并取平均值。用SPSS 11.5软件的One-way ANOVA程序进行统计学分析。
1.8 Western blot方法检测蛋白表达
分别收集rDEV-EF1和rDEV-ΔVP26感染细胞样品，加入上样缓冲液混匀，100℃加热10 min，离心，取10μL蛋白上清液于蛋白预制胶(10%~20%)电泳，电泳时制备双份，电泳完毕，分别转印至小孔径NC膜(0.22μm)和NC膜(0.45μm)，放入封闭液中4℃封闭过夜。以小鼠源抗VP26多克隆抗体(1∶500稀释)或小鼠抗UL19蛋白多克隆抗体(1∶500)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀释)作为二抗于37℃孵育1 h，PBST洗涤完毕后，加入ECL化学发光试剂作用5 min，最后于凝胶成像系统下曝光显色。
1.9 UL35基因缺失病毒的安全性分析
将40只30日龄无DEV抗体的麻鸭随机分为5组，每组8只并饲养于不同栏舍。每组麻鸭分别在腿部肌肉注射1 mL 1×105 TCID50的rDEV-ΔVP26、rDEV-EF1和1 mL 1×106 TCID50的rDEV-ΔVP26、rDEV-EF1，对照组注射1 mL DMEM。观察2周，记录各组鸭的状态、发病和死亡情况来评价rDEV-ΔVP26对鸭的安全性。
1.10 UL35基因缺失病毒的免疫原性分析
将48只30日龄无DEV抗体的麻鸭随机分为6组，每组8只，各组分栏舍饲养。每组麻鸭腿部肌肉分别注射1 mL 1×104 TCID50 rDEV-ΔVP26、rDEV-EF1和1 mL 1×105 TCID50 rDEV-ΔVP26、rDEV-EF1，对照组注射1 mL DMEM，留1组作为阴性对照组(NC组)，不做任何处理。免疫14 d后用鸭瘟强毒CHv株(100倍鸭半数致死剂量，100 DLD50)对免疫组和DMEM对照组采用肌肉注射的方式进行攻毒，NC组不做任何处理。于2周内观察各组鸭的状态、发病和死亡情况，通过各组发病、存活情况来评价rDEV-ΔVP26对鸭瘟强毒株的免疫?；で榭?。试验过程中所有死亡鸭立即进行剖检、观察鸭各脏器病变和进行PCR检测。
1.11数据的统计与分析
采用GraphPad Prism 5软件的t检验(Student′s t test)比较各组之间的差异性，ns.无显著差异；*.P＜0.05表示差异显著；**.P＜0.01、***.P＜0.001、****.P＜0.000 1均表示差异极显著。
2结果
2.1 UL35基因缺失突变体克隆的PCR鉴定
抽提重组BACs克隆，以其为模版、ΔVP26-JD-F/ΔVP26-JD-R为引物对进行PCR扩增，结果表明UL35基因按照预期缺失(图1)。
M.2000 bp相对分子质量标准(2 000、1 000、750、500、250、100)；1.pDEV-EF1(949 bp)；2.pDEV-ΔVP26-Kan(1 634 bp)；3.pDEV-ΔVP26(595 bp)
图1 UL35基因缺失突变体克隆的PCR鉴定
2.2 UL35基因缺失突变体病毒的拯救和鉴定
以pDEV-ΔVP26质粒转染CEFs细胞后24 h，在荧光显微镜下可以见到绿色荧光蚀斑(图2)，表明成功拯救了UL35基因缺失病毒rDEV-ΔVP26。rDEV-ΔVP26可以在CEFs细胞上增殖和形成蚀斑，说明UL35基因不是DEV在细胞上增殖所必需的。抽提病毒DNA，以ΔVP26-JD-F/ΔVP26-JD-R引物对进行PCR扩增，再次验证UL35基因缺失成功(图3A)。采用Western blot方法对rDEV-ΔVP26感染细胞中VP26蛋白的表达进行检测，发现VP26蛋白成功缺失，而对照组rDEV-EF1感染细胞内正常表达。且两组样品都能检测到病毒主要衣壳蛋白UL19(图3B)。
图2拯救的重组病毒rDEV-ΔVP26(100×)、对照病毒rDEV-EF1(100×)和正常细胞对照
M1.2 000 bp相对分子质量标准(2 000、1 000、750、500、250、100)；1.rDEV-EF1(949 bp)；2.rDEV-ΔVP26(595 bp)；M2.蛋白质相对分子质量标准
图3 PCR方法(A)和Western blot法(B)验证rDEV-ΔVP26病毒UL35缺失
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