林氏扇头蜱抗菌肽重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线影响及抑菌效果（一）
摘要
目的探究林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like基因的抗菌功能，为了解林氏扇头蜱先天免疫系统和开发蜱类防控药物、新型抗菌药物替代提供新的参考依据。方法根据林氏扇头蜱Microplusin-like基因序列设计特异性引物，提取林氏扇头蜱RNA并反转录为cDNA，通过PCR扩增基因片段，将基因片段连接至pCold-SUMO质粒，构建重组表达载体pCold-SUMO/Microplusin-like后，转入大肠埃希菌Rosetta（DE3）感受态细胞，经诱导表达、纯化后获得蛋白；通过滤纸片法测定重组蛋白对大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈，通过微量对倍稀释法测定其对大肠埃希菌、沙门菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），并通过测定该蛋白对大肠埃希菌生长曲线、时间-杀菌曲线的影响探究其抑菌效果；通过扫描电镜及透射电镜观察重组蛋白对大肠埃希菌微观形态的影响，并结合分子对接技术探究重组蛋白的抑菌机制。结果林氏扇头蜱Microplusin-like基因扩增所得片段长度为333 bp，构建了原核表达载体pCold-SUMO/Microplusin-like，经诱导表达、纯化后获得蛋白，大小约为29 kDa。抑菌试验结果表明，重组蛋白对大肠埃希菌（ATCC 25922、1515、987P、K88、K99）及鸡白痢沙门菌CVCC1791的抑菌圈直径分别为15.8、20.58、18.33、15.4、18.24、18.18 mm，表现出中度或高度敏感；MIC（MBC）分别为0.625（5）、0.625（>5）、0.625（5）、1.25（>5）、0.625（>5）、0.625（>5）mg/mL，存在一定差异；对金黄色葡萄球菌无抑制作用；生长曲线及时间-杀菌曲线测定发现，重组蛋白抑菌活性呈浓度依赖性。扫描及透射电镜显示经重组蛋白处理后大肠埃希菌菌体皱缩，边缘模糊，细胞壁及细胞膜出现破损，内容物外泄，细胞内部松散。分子对接显示蛋白通过氢键、盐桥及疏水作用与大肠埃希菌外膜脂多糖转运蛋白结构发生结合。结论林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like蛋白具有抗革兰阴性菌活性，初步分析抗菌机制为破坏细胞壁及细胞膜结构，为开发蜱的新防治策略、新型抗生素替代提供了参考依据。
林氏扇头蜱（Rhipicephalus linnaei）是我国热带地区常见蜱种之一，通过形态学和分子生物学研究被鉴定为血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）的热带谱系，主要寄生于犬类和其他哺乳动物，是多种病原体（如立克次体、巴贝斯虫）的传播媒介?？咕脑隍绲难赴?、脂肪体、中肠、卵巢和唾液腺等组织中均有表达，现已分离的蜱抗菌肽主要为血红蛋白、防御素、溶菌酶、Microplusin等。Microplusin首次在微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）的血淋巴中被分离，通过螯合铜离子限制菌的呼吸从而对白色念球菌（Candida albicans）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）等革兰阳性菌及部分真菌起到抑制作用，但对革兰阴性菌无效。目前，Microplusin这一名称专指从微小扇头蜱中分离鉴定的，在其他蜱类中检测或分离到的类似蛋白则被命名为Microplusin-like。Microplusin-like是蜱虫防御系统的重要组分，对多种病原体具有抑制作用，但不同蜱类中的Microplusin-like抗生作用有所不同，该类蛋白可开发成多种药物。
本研究基于林氏扇头蜱转录组数据，通过原核表达获得Microplusin-like重组蛋白，进一步探究其抗菌功能与机制，为开发蜱类防控药物和新型抗菌药物替代提供新的参考依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
大肠埃希菌（Escherichia coli ATCC 25922、K88、K99、987P、1515），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 43300、CVCC 1882），鸡白痢沙门菌（Salmonella pullorum CVCC 1791）由中国热带农业科学院品资所畜牧研究室馈赠。
1.1.2主要试剂与仪器
总RNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，DH5α、Rosetta（DE3）感受态细胞购自深圳康体生物医药科技有限公司，pCold-SUMO质粒购自湖南丰晖生物科技有限公司，MHB肉汤培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，MHA琼脂培养基购自北京索莱宝科技有限公司；电泳仪与凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）、多功能微孔板检测酶标仪（瑞士Tecan公司）、荧光定量仪（美国Roche公司）、扫描电子显微镜（日本HITACHI公司）、透射电子显微镜（日本JEOL公司）；引物合成和基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.1.3林氏扇头蜱
林氏扇头蜱采集自海南某犬舍，于海南大学生命健康学院病媒生物学实验室进行寄生传代培养，传代宿主为新西兰大白兔，培养条件为恒温培养箱温度（27±1）℃、相对湿度（90±5）%。
1.2方法
1.2.1 Microplusin-like基因扩增
从NCBI获取Microplusin-like基因序列（XM_037665332.2），使用Snapgene软件设计引物（引物上游序列：5'-ATGAAGGCCGTCTTCGTCT-3'；下游序列：5'-TTAATGGCCGTCACCATGG-3'）。利用Trizol法提取林氏扇头蜱总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA后进行PCR扩增。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收纯化，后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
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