枯草芽孢杆菌生长曲线的测定、来源OMVs的分离纯
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种最常见的菌种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，并且该菌种是植物体内常见的内生细菌，加上枯草芽孢杆菌生长快，营养比较简单，能产生耐热、抗逆的芽孢，所以不少菌肥(剂)中都添加了它。当然，这个枯草芽孢杆菌被广泛运用还因为它在增强作物抗性、促进作物生长、改良土壤、提高作物品质等方面的强大作用?？梢运?，用得好，它既是药，又是肥，还是植物生长调节剂。那么枯草芽孢杆菌生长曲线如何绘制？下面提供详细步骤。
枯草芽孢杆菌生长曲线的测定：
将-80℃保存的枯草芽孢杆菌甘油冻存液，按1︰100的比例接种到5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm/min条件下培养至菌液OD600值为0.6左右。配制两瓶100mL无菌的LB培养基，按1︰100的比例将OD600值为0.6左右的种子菌液无菌接种到100mLLB培养基中，其中一瓶不接种，作为阴性对照组。于37℃、200rpm/min的恒温摇床中培养，分别于培养的0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h取出1mL菌液，在96孔板中每孔加入200μL菌液，每个时间点设置3个复孔，在酶标仪中检测OD600值，制作枯草芽孢杆菌的生长曲线。选取枯草芽孢杆菌处在稳定生长期的初期阶段，进行枯草芽孢杆菌来源OMVs的分离纯化。
枯草芽孢杆菌来源OMVs的分离纯化：
按1︰100的比例，将100μL枯草芽孢杆菌甘油冻存液无菌接种到10mLLB培养基中，于37℃、200rpm/min条件下培养至菌液OD600值为0.6左右。将上述250μL枯草芽孢杆菌种子液无菌接种到含250mLLB培养基的1L培养瓶中(两瓶)，于37℃、200rpm/min的恒温摇床中培养至稳定生长期的初期阶段。收集处于稳定生长期初期阶段的枯草芽孢杆菌培养液500mL，在4℃，15000g条件下离心20min去除细菌后取上清液，过0.45μm滤膜去除杂质后收集上清液，上清液过0.22μm滤膜后收集上清，将上清经100kD滤膜进行超滤处理，去除蛋白质等大分子杂质，用200μL无菌PBS溶液溶解沉淀物，得到枯草芽孢杆菌来源OMVs的浓缩液。