青贮乳酸菌生长曲线、产酸和抑菌能力、抗生素耐药性测定（二）
1.2.4 乳酸菌抑菌能力的测定
以金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coil)和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)为指示菌配制105 CFU/mL的4 mm直径孔平板，加入菌液5 μL，30 ℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
1.2.5 抗生素敏感性的测定
将待测菌加入40 ℃的MRS培养基中，接种量1%，摇匀后倒平板。将卡那霉素、庆大霉素和青霉素药敏片贴至培养基表面，30 ℃培养24 h，使用电子游标卡尺测量抑菌圈直径，通过CLSI指南确定其抗生素敏感性。
1.2.6 发酵试验
将蚕豆秸秆和磨碎米糠按照3∶1 (质量比)混合，向其中加入R-01菌液(1 mL/kg)作为试验组，对照组加入同体积无菌水?；煸群蟾髯榉肿?份作为平行试验组，抽真空发酵35 d。发酵完成后每个平行组分别取1个样品，测定pH值，根据《青贮饲料质量评定标准》进行感官评价，并测定含水率以及中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、干物质、粗灰分、粗蛋白、粗纤维和粗脂肪含量。
1.2.7 饲料霉菌毒素含量的测定
使用ELISA试剂盒构建标准曲线，并测定青贮饲料中呕吐毒素、T2毒素和黄曲霉毒素的含量。
1.2.8 数据统计与分析
结果用“平均值±标准误”表示。用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，两两比较用t-检验，多组间比较用one-way ANOVA检验。
2. 结果与分析
2.1 菌种筛选结果
从巨菌草青贮中分离出7株可以抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的菌株，利用凝胶打孔法对7株菌进行对比，筛选出1株抑菌圈直径最大、透明度高的菌株，命名为R-01 (图1)。
图 1 乳酸菌对3种病原菌的拮抗能力分析
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 菌落形态学特征
R-01在MRS培养基上生长时呈典型的乳酸菌特征：乳白色、圆形、凸起，革兰氏阳性；单菌落镜检呈杆状、单生或多个串生(图2 )。
图 2 菌落形态特征(a)和革兰氏染色结果(b)
2.3 菌种鉴定结果
经测序和比对，R-01与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) KJ026699.1、KX078316.1、ON254155.1、AB904768.1、MT613642.1、MT611702.1、MT604643.1和MT538617.1的同源性高达100% (图3和图4)。综合形态学特征及染色结果，将R-01鉴定为植物乳杆菌，命名为L. plantarum R-01，并获得其GenBank登录号为OP459306。
图 3 植物乳杆菌R-01的16S rRNA序列系统进化树
图 4 植物乳杆菌R-01的同源性比较
2.4 生长和产酸曲线
由图5可知：R-01生长停滞期很短，0~2 h生长速度较缓慢，2 h后进入对数期，14 h后进入稳定期，随后略有降低，但基本保持一致；随着时间推移，R-01的pH值呈下降趋势，18 h达到最低值(3.6)，随后略有浮动，但基本保持一致。
图 5 植物乳杆菌R-01的生长和产酸曲线
2.5 乳酸菌对抗生素的敏感性
R-01对青霉素产生的抑菌圈直径为(4.40±0.16) mm，对卡那霉素和庆大霉素产生的抑菌圈直径均为(0±0) mm。根据CLSI耐药性指南的判断标准(抑菌圈≤14 mm即为具有耐药性)，R-01对上述3种抗生素均具有耐药性。
2.6 乳酸菌对蚕豆秸秆的发酵能力
由表1可知：与对照组相比，试验组的pH值极显著降低(P<0.01)，粗蛋白含量显著降低(P<0.05)，粗纤维含量显著增加(P<0.05)，粗脂肪含量极显著增加(P<0.01)。青贮感官评价结果显示：添加R-01发酵后，蚕豆秸秆呈黄绿色，芳香酸味；对照组蚕豆秸秆呈黄褐色，有轻微刺鼻酸味；两者的茎叶结构均保持良好；试验组的等级优于对照组。
表 1 化学成分分析
| 表 1 化学成分分析 | Table 1. Chemical composition analysis | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
|
组别 groups |
含水率/% water content |
干物质/% dry matter |
粗灰分/% crude ash |
粗纤维/% crude fiber |
中性洗涤纤维/% neutral detergent fiber |
酸性洗涤纤维/% acid detergent fiber |
粗蛋白/% crude protein |
粗脂肪/% crude fat |
pH值 pH value |
|
对照组 control group |
58.17±0.19 | 96.99±0.61 | 13.34±0.06 | 23.01±0.51 | 60.39±0.34 | 60.09±0.18 | 5.45±0.00 | 0.38±0.06 | 4.26±0.01 |
|
试验组 experimental group |
57.94±0.04 | 96.16±0.45 | 13.10±0.09 | 25.50±1.01* | 59.77±0.33 | 59.74±0.46 | 5.28±0.02* | 1.10±0.16** | 4.03±0.01** |
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