双黄连及各药耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线、毒力因子的影响（一）
【摘要】
目的 探究双黄连及其各药在亚抑菌浓度下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）毒力因子α-溶血素（Hla）和分选酶A(SrtA)活性的影响，为临床中药治疗感染性疾病提供新思路。
方法 采用纸片扩散、最低抑菌浓度（MIC)和时间-生长曲线评估双黄连及各药对MRSA生长的影响；溶血实验、Hla中和实验、蛋白免疫印迹法探究双黄连及各药对Hla活性影响及作用机制；荧光共振能量转移测定法（FRET）、生物被膜形成和分子对接技术鉴定双黄连及各药对SrtA的活性影响及作用机制。
结果 双黄连整方MIC为16 mg·mL?1，抑菌圈比值为（66.11±14.92）%。1/32 MIC浓度的双黄连即可抑制和中和Hla的作用，且浓度越高抑制作用越强，呈浓度依赖性。FRET结果证实双黄连对SrtA活性有抑制作用，抑制率为86.1%。与对照组相比，1/8 MIC浓度即表现对生物被膜明显抑制作用。分子对接结果显示SrtA与双黄连中主要抑菌活性成分有较好的结合能力。单味药中连翘抑菌能力强，MIC为16 mg·mL?1，在亚抑菌浓度下只影响溶血活性及生物被膜的形成但不抑制细菌的生长。金银花、黄芩不仅影响溶血活性以及生物被膜形成，还对SrtA活性产生抑制作用。其中金银花溶血效果强，在1/32 MIC浓度时即可显著抑制和中和Hla的作用，而黄芩在相同浓度下对生物被膜抑制作用显著。3味药不同程度对SrtA和Hla的活性发挥抑制作用。
结论 双黄连及各药在亚抑菌浓度下不影响MRSA的生长，但全方共同作用抑制Hla和SrtA的活性，从而减弱MRSA的毒性。
引言
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染所引发的肺炎是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型患者并发症和死亡的重要原因之一，临床可能表现为轻度呼吸道感染或严重呼吸衰竭和脓毒性休克。抗生素的滥用可诱导细菌产生多重耐药性，此外，亚抑菌浓度的抗菌药物也是诱导细菌产生耐药的重要原因，已有研究表明，亚抑菌浓度的抗生素可影响生物被膜的形成、细菌黏附和侵袭、细菌毒力因子表达，诱导耐药的产生等。寻找能在不同环节阻断耐药菌生长，且避免细菌产生耐药性的抗感染药物是临床治疗的难题。
对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus)致病机制的深入研究，发现其分泌的毒力因子在疾病的发展过程中发挥至关重要的作用。α-溶血素（α-hemolysin, Hla）是一种水溶性造孔细胞毒素，其溶解特性使得Hla介导的细胞死亡能够在易感细胞质膜上形成跨膜孔，从而导致细胞内物质泄漏，这一机制与S. aureus引起的感染性疾病如皮肤软组织感染和肺炎等密切相关。另一个重要靶点分选酶A（sortase A, SrtA）是一种被广泛研究的膜定位转肽酶，它介导凝集因子A/B、纤连蛋白结合蛋白和胶原黏附素等多种表面蛋白共价锚定在细菌细胞壁，促进细菌在宿主组织中的入侵、粘附、生物膜形成和免疫逃避等，对S. aureus感染的发生起关键作用。不同于传统抗生素疗法，抗毒力因子策略通过抑制病原体毒力因子的合成与分泌达到治疗目的，该方法对细菌施加的选择压力较小，且降低了细菌产生耐药性的风险。因此，靶向SrtA和/或Hla的抗毒力药物可能会对MRSA感染造成双重打击，并减缓耐药性的发展。
双黄连由《温病条辨》中的经典名方银翘散精简化裁而来，由金银花、黄芩和连翘3味药材组成，该方对于MRSA感染引起的肺炎或外感风热所致的发热、咳嗽、咽痛等症状均有较好疗效。目前关于双黄连的抗菌作用机制尚不完善，本研究从抗毒力策略的角度，以MRSA主要致病的毒力因子Hla和SrtA为研究对象，探究双黄连减弱MRSA致病性的作用及机制所在，以期为中药新药研发提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 菌株
研究中使用的MRSA USA300菌株（ATCC BAA-1717)购自美国典型培养物收藏中心，USA300 srtA缺失菌株（ΔsrtA）储存在我们的实验室中。
1.2 试剂
连翘、金银花、黄芩（北京本草方源药业集团有限公司，批号：20230804、20240408、230102）；胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）、阳离子调节的Mueller－Hinton（CAM-HB）及胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（青岛海博生物技术有限公司，批号分别为HB4114、HB6231－1、HB0177）；二甲基亚砜（DMSO，武汉塞维尔科技生物有限公司，批号：GC203002）；无菌抗凝兔血（北京平睿生物，批号：20230610）；万古霉素（maikelin，批号：V871983-250mg）；溶菌酶（上海碧云天生物技术有限公司，批号：AF5312）；溶葡萄球菌酶（上海碧云天生物技术有限公司，批号：AF5225）；特超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0018M）；彩色预染蛋白marker（Biosharp，批号：BL713A）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（H+L）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C2015M）；Ni-NTA柱料（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P2210）；荧光底物Abz－LPATG－Dap（Dnp）－NH? 由Lifetein, LLC（中国北京）合成。
1.3 仪器
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统；Multiskan Go酶标仪（Thermo Scientific）；低温离心机（Thermo Scientific）；紫外分光光度计（浙江纳德科学仪器有限公司）；全自动高压灭菌锅SX-500（上海天美仪拓实验室设备有限公司）；电泳仪JY600E（北京君意东方电泳设备有限公司）；流式细胞仪（Beckman-Colter, USA）。
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