青贮饲料中耐高温乳酸菌的生物学特性及发酵特性研究（一）
摘要:为提高湿热地区青贮饲料的品质，本研究首先分析了从西南高温高湿地区青贮饲料中分离到的227株天然乳酸菌种群结构，再根据乳酸菌在高温条件下的生长活性和产酸能力筛选到4株优质乳酸菌(LP149、LS358、LR753和LPA761)，并对菌株生理生化特性和生长、产酸曲线进行了测定。结果表明，天然植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是高温高湿地区青贮料中最常见的乳酸菌菌株(占62.55%)，其次是鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)和副干酪乳杆菌(L.paracasei)，分别占总乳酸菌的13.21%和9.25%。所筛选的4株菌株为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的杆状菌，能够在pH 3.5和45℃的条件下生长。根据生理、生化特征和16S rRNA测序分析，LP149、LS358、LR753和LPA761分别被鉴定为植物乳杆菌、唾液乳杆菌(L.salivarius)、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌。在37和45℃条件下的菌株生长和产酸曲线结果表明，筛选出的4株乳酸菌有良好的高温适应性(45℃)，不仅生长速度快，产酸能力强，耐盐性较好，对糖源利用范围广，而且对酸性环境有较好的适应性，可以作为后续进行高温青贮回填试验的候选菌株。
青贮是保持饲料营养价值最有效的技术之一，其品质取决于青贮自然发酵过程，即青贮后立即由同型发酵乳酸菌进行发酵，从而导致饲料酸化，抑制有害微生物生长。然而，在热带和亚热带地区难以生产出高品质的青贮饲料。这些地区在夏季大规模青贮生产过程中经常遭受高温和大量降水等不利天气条件，严重影响青贮发酵和有氧稳定性。青贮原料附生乳酸菌在生产优质青贮饲料中发挥着重要作用。然而，乳酸菌并不是植物上唯一的微生物，梭状芽孢杆菌、肠杆菌、酵母和霉菌也常生长于植物上，并与乳酸菌竞争水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)。此外，植物上附着的天然乳酸菌种群因植物而异，数量从(1×102)～(1×109)cfu·g–1鲜样(fresh matter,FM)不等?；肪程跫不嵊跋熘参锷细阶诺娜樗峋俊６樗峋亢突钚允且种撇涣嘉⑸锷ず图跎俜⒔退鹗У囊桓鲋匾蛩?，自然发酵品质取决于青贮材料上初始乳酸菌数量和底物的含量。在温暖地区生长的青贮原料上附着的乳酸菌数量和种类比在寒冷地区的更多、更丰富。因此，了解湿热地区青贮原料上附着的天然乳酸菌组成是调制优质青贮饲料的前提。
当青贮发酵受环境影响时，乳酸菌常被作为青贮饲料添加剂，用于提高青贮发酵品质。然而，并非所有的乳酸菌接种剂都能在大多条件下获得良好的发酵效果，尤其是在高温高湿的环境中。在青贮初期，当空气仍然存在于植物间隙时，由于植物呼吸和好氧微生物的持续活动，温度可能会上升到40℃以上。青贮饲料在夏季可能会长时间受高温的影响，特别是在热带和亚热带地区。Chen等报道了一种商业乳酸菌接种剂LP(Lactobacillus plantarum和Pediococcus acidilactici混合)不能适应较高温度下(45℃)的青贮环境。此外，研究表明，商业乳酸菌接种剂(L.plantarum MTD-1)对高温青贮(50℃)没有任何帮助，而分离的两株菌株(P.acidilactici GG13和L.rhamnosus GG26)通过降低pH、丁酸、铵态氮(NH3-N)和乳酸含量提高了象草(Pennisetum purpureum)高温青贮质量。这些研究表明，由于商业乳酸菌的筛选与使用多在温带地区，高温会在一定程度上影响其使用效果，在当地条件下筛选的乳酸菌菌株则有更佳的适应性。
综上，了解湿热地区的青贮原料上乳酸菌种群是提高该地区青贮的前提，筛选适宜当地条件的优质乳酸菌是提高该地区青贮饲料发酵质量的关键。因此，本研究的目的是调查高温高湿地区乳酸菌组成，筛选适宜的当地乳酸菌菌株，探明耐高温乳酸菌的生物学特性及发酵特性，为后续的乳酸菌添加剂的研究提供理论支撑。
1.材料和方法
1.1样品采集和菌株分离
样品为3个品种的玉米(Zea mays)(雅玉8号、中单808号和多玉3号)和桂牧一号杂交象草[(P.purpureum‘Mott’)×(P.americanum×P.purureum)]‘Guimu No.1’及其分别制成的青贮饲料，均来自中国西南高温高湿地区(表1)，玉米原料为乳熟期的全株玉米，杂交象草在高度大于1.5 m时收获。全株玉米青贮样品在大窖中发酵两个月后取样，杂交象草青贮样品则在裹包青贮3个月后取样。
表1青贮前后样品信息及227株乳酸菌鉴定结果、分布详情
原料和青贮样品均称取20 g于180 mL无菌蒸馏水中在4℃下震荡1 h，再在无菌蒸馏水中连续稀释1×10–1至1×10–10。在MRS培养基(陆桥科技有限公司，北京，中国)中37℃培养48 h后对乳酸菌进行分离，为了确保真实地反映原料和青贮中乳酸菌群落结构，从每种样品MRS培养基中随机抽取20～40株菌株，共收集251株菌。通过革兰氏染色和过氧化氢酶试验确定其中227株为乳酸菌。将227株乳酸菌放入加有甘油的保藏管中–20℃保存。
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