孢汉逊酵母、美极梅奇酵母等菌株生长曲线测定及酿酒因子耐受性分析（二）
1.4葡萄汁发酵试验
‘美乐’葡萄除梗、压榨破碎后，加入20 mg/L果胶酶和30 mg/L SO2，4℃浸渍24 h。浸渍结束后，参照LI等的方法，将葡萄醪在68℃下巴氏灭菌30 min后，迅速置于冰水中失活天然本土酵母菌群。取2 L葡萄醪液加入2.5 L棕色瓶中，接入酵母进行发酵。发酵瓶用8层纱布封口，发酵温度控制在25℃。取样时严格无菌操作。
菌株接种：分别将供试NS菌株培养液离心和无菌水洗涤，用灭菌葡萄汁溶解后以1×106 cfu/mL接入发酵瓶中，每组试验设置3个生物学平行。每24 h定时取样，监测酵母生物量、还原糖与乙醇含量变化，连续2 d还原糖消耗量小于2 g/L即视为发酵结束。各处理取样4℃保存，进行后续相关指标检测。
1.5酵母生物量测定
发酵过程中每24 h取样，稀释至10?4、10?5和10?6 3个梯度，分别均匀涂布于WL培养基。28℃恒温培养3 d后进行平板计数。所有样品均重复3次。
1.6酒样酿酒学指标测定
发酵结束后，酒样pH值、总酸、挥发酸和酒精度的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行。并参照下式计算不同NS菌株纯种发酵后的还原糖消耗量、乙醇产量和乙醇产率。
式中Gc为还原糖消耗量，g/L；G0为还原糖初始量，g/L；Gr为还原糖剩余量，g/L；M为乙醇产量，g/L；φ为乙醇体积分数，%；ρ为乙醇密度，g/L；Y为乙醇产率，%；
甘油、苹果酸质量浓度通过多功能葡萄酒分析仪（WineScan?3）检测。
测定总酚、总花色苷。总酚测定采用福林酚法，以没食子酸质量浓度表示。总花色苷含量测定采用pH示差法。
吸取1 mL酒样，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释10倍，之后在420、520、620 nm下测定吸光度，三者之和为酒样的色度，前二者吸光度之比即为色调值。
1.7酒样挥发性化合物测定
使用顶空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对不同处理酒样挥发性化合物进行检测。取8 mL酒样于15 mL顶空瓶中，加入2.4 g NaCl和10μL 2-辛醇（质量浓度为81.06 mg/L），加磁力搅拌转子后封口，置于恒温磁力搅拌器中，40℃水浴平衡30 min后顶空萃取30 min。GC-MS分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱（60 m×2.5 mm×0.25μm）；进样口温度240℃，进样5 min，不分流进样；柱温升温程序：初温50℃保持5 min，再以3.0℃/min升温至200℃，保持15 min；载气高纯氦气（He）流速1 mL/min；MS条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；质谱扫描范围20～350 m/z。
定性定量分析：对于已有标准品的香气化合物通过内标标准曲线法进行定量，其他香气化合物含量利用内标法进行相对定量分析。
1.8数据分析
采用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据处理，并用IBM SPSS Statistics 26.0对数据进行显著性分析。其中，采用单因素方差分析（Duncan法，P＜0.05）进行差异显著性分析，试验数据以平均值±标准差表示。TBtools、SIMCA 14.1与Origin 2021软件用于绘图。
将酿酒学参数与主要挥发性化合物测定结果相结合进行多元统计分析。对数据标准化后使用Origin 2021进行层次聚类分析；选取代表性菌株的新数据集进行偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），采用SIMCA 14.1提取结果并将其可视化，并利用Origin 2021绘制各变量相关回归系数的条形图。
2.结果与分析
2.1非酿酒酵母菌株生长曲线
由供试NS菌株在YPD液体培养基中的生长曲线（图1）可知，同一种属菌株表现出相似的生长趋势，而不同种属间的生长情况有一定差异。其中T.delbrueckii菌株（HX-6、HX-7）在经历4 h延滞期后迅速进入对数生长期，28 h左右达到稳定期，最终OD600值达到1.4左右，生长速度和光密度值明显高于其他菌株；H.uvarum菌株（HX-1、HX-3）同样经历4 h延滞期后，在8～12 h期间生长速度较快、12～32 h期间生长较为缓慢并逐步达到稳定期；M.pulcherrima菌株（HX-2、HX-4）对数生长期持续时间较长，40 h左右达到稳定期，最大OD600值为1.102与1.098。
图1非酿酒酵母菌株在YPD培养基中的生长曲线
注：HX-1、HX-3为H.uvarum；HX-2、HX-4为M.pulcherrima；HX-6、HX-7为T.delbrueckii。
2.2酿造因子耐受性
本土NS菌株对葡萄酒相关酿造因子的耐受性见图2。除HX-6菌株外，其余菌株的生物量均随葡萄糖质量浓度的增加而呈现下降趋势。葡萄糖质量浓度达到300 g/L时，HX-1、HX-3、HX-4菌株的OD600值明显低于其他菌株（图2a），表明其在高糖分条件下受到的抑制作用更强。由图2b可知，所有菌株在10℃的低温条件下均无法生长；15℃条件下，HX-2和HX-4菌株的生长情况明显弱于其他菌株，而在35℃时，HX-1、HX-3菌株生长活力明显下降。整体而言，同一种属菌株对发酵温度的耐受性具有一定相似性，不同种属菌株对发酵温度的耐受性存在明显差异。
图2非酿酒酵母菌株酿造因子耐受性
图2c表明，6株NS菌株在SO2质量浓度小于200 mg/L的范围内，均能够正常生长；SO2质量浓度达到300 mg/L时，除HX-6菌株外，其余菌株的生长仅受到轻微抑制，说明供试NS菌株具有较好的SO2耐受性。HX-7菌株在pH值为2.0和2.5的条件下无法生长，而HX-3菌株在pH值为2.0时生长受到轻微抑制；HX-2、HX-4、HX-6菌株随着pH值的增加呈现OD600值升高的趋势，HX-1菌株的光密度值在不同pH值条件下波动不大（图2d）。图2e中，NS菌株均能耐受体积分数为3%的乙醇，当乙醇体积分数达到6%时，除T.delbrueckii（HX-6、HX-7）外，其余酵母菌株的生长均受到不同程度的抑制；乙醇体积分数达到9%时，HX-1、HX-3（H.uvarum）、HX-2、HX-4（M.pulcherrima）菌株均无法生长，但HX-6菌株的OD600吸光度值达到0.569，菌株生长受到一定抑制。
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