不同温度下金属螯合剂对鳗弧菌生长曲线的影响（一）
摘要
鳗弧菌(Vibrio anguillarum) 是一种水产动物的重要致病菌，鳗弧菌分泌的胞外蛋白酶是该菌的致病因子之一。研究了环境因子对鳗弧菌W-1生长及胞外蛋白酶表达的影响。结果表明,鳗弧菌的最适生长温度为28°C，菌体生长量在21 h达到最高，胞外蛋白酶的活力在24 h最高。在37 °C培养时，菌体生长和酶活力显著降低；添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳源物质均能显著促进菌体的生长，但对于胞外蛋白酶表达有明显抑制作用；1 mmol/L EGTA对菌体的生长和胞外蛋白酶表达没有明显影响,而1 mmol/L的EDTA强烈抑制鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的表达。添加不同浓度的氨苄青霉素对菌体的生长及其胞外蛋白酶表达有明显的抑制作用。
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产动物的一种重要的致病菌，能引起世界范围内的淡水、海水鱼类及其他动物发生弧菌病，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。已发现鳗弧菌毒力因子有质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白等。胞外蛋白酶也是鳗弧菌的一种重要的致病因子，Inamura等从一株致病性O1血清型的鳗弧菌PT81049胞外产物分离纯化了一种金属蛋白酶，SDS-PAGE电泳分析酶的分子质量为36 u，该蛋白酶腹腔注射金鱼和小鼠的LD50分别为1.7 μg/g和1.6 μg/g，Milton从鳗弧菌NB10克隆了金属蛋白酶基因，编码611个氨基酸残基组成的多肽链，完整蛋白的分子质量为66.7 u。作者从山东沿海养鱼场发病鱼分离的致病性鳗弧菌W-1胞外产物中分离纯化了1种胞外蛋白酶，对酶的理化性质研究表明，该酶是一种金属蛋白酶，纯化的酶注射鱼后能引起鱼的组织损伤和死亡，该酶由611个氨基酸残基组成，预测酶的活力中心氨基酸组成与霍乱弧菌、创伤弧菌等的酶活力中心相似。已知病原菌的生长及致病性跟其所处的环境密切相关，其毒力因子的表达受体内外各种环境因子的影响，作者研究了在体外培养条件下，各种环境因子对鳗弧菌W1生长及胞外蛋白酶表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验菌株
致病性鳗弧菌W-1分离自山东省莱州湾海区发病的花鲈(Lateolabrax japanicus)，经细菌形态学、生理生化及Biolog系统鉴定为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
1.2 菌体培养及胞外产物的获得
鳗弧菌的培养采用2216E海水液体培养基，培养温度28°C，振荡频率为 180 r/min。培养物于4 °C 10 000 r/min离心 10 min，收集上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤去除残余菌体,即得胞外产物。
1.3 菌体浓度、胞外产物蛋白含量及蛋白酶活力的测定
菌体浓度测定：鳗弧菌培养物用生理盐水稀释后，于600 nm波长下测定吸光值(A)。
蛋白质含量测定按Bradford方法进行，以牛血清白蛋白为标准。
蛋白酶活力测定：参照Inamura方法，以偶氮酪蛋白为底物。在规定的条件下A值每增加0.001被定义为1个酶活力单位(U)。
1.4 培养方法
1.4.1 温度对鳗弧菌生长和蛋白酶表达的影响
菌体接种于2216E海水培养基，分别在15,28,37 °C条件下培养，振荡频率180 r/min，不同时间取样，在600 nm波长测菌体浓度，并测定蛋白酶活力。
1.4.2 碳源物质对鳗弧菌生长和蛋白酶表达的影响
2216E海水培养基中添加1%不同的碳源物质(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖)，在28°C培养，不同时间取样，在600 nm波长测菌体浓度，并测定蛋白酶活力。另外，在培养基中添加不同质量分数的葡萄糖(0.1%,0.5%,1%,2%)，用相同的方法测菌体浓度和酶活力。
1.4.3 抗生素对鳗弧菌生长和蛋白酶表达的影响
在培养基中添加10,50,100 mg/L氨苄青霉素，在28°C培养，不同时间取样，在600 nm波长测菌体浓度，并测定蛋白酶活力。
1.4.4 EDTA 和 EGTA对鳗弧菌生长和蛋白酶表达的影响
培养基中分别添加1 mmol/L的EDTA和 EGTA，在28°C培养，不同时间取样，在600 nm波长测菌体浓度，并测定蛋白酶活力。
2 结果
2.1 温度对鳗弧菌生长及胞外蛋白酶表达的影响
在28 °C条件下培养，菌体生长和蛋白酶活力最好，从6~24 h处于对数生长期,在24 h时菌浓度达到最大；同步检测了鳗弧菌分泌的胞外蛋白酶的活力，蛋白酶分泌与菌体生长基本同步，活性随着菌体的生长逐渐升高,并在24 h达最大分泌量, 约36 h后缓慢下降（图1）。15 °C条件时菌体生长和酶活力都有一定降低，但差异不显著（P>0.05），在37 °C条件下，菌体的生长和胞外蛋白酶的表达均受到显著的抑制（P<0.05）。
图1 温度对鳗弧菌W-1菌体生长及胞外蛋白酶表达的影响