百里香酚MIC和生长曲线测定及对金葡菌Hla的作用机制（二）
1.2.3百里香酚对金葡菌上清液溶血能力的影响
将金葡菌培养至OD600 nm=0.3，加入百里香酚使其质量浓度分别达到0、4、8、16和32μg/mL，培养至稳定期，离心(4 500 r/min，5 min)取菌上清100μL，加入到880μL PBS中，再加入20μL脱纤维兔血，混匀，37℃培养30 min，离心(4 500 r/min，2 min)取上清，在543 nm波长处测定吸光值，以不加药组为100%溶血。
1.2.4蛋白免疫印迹分析
取1.2.3节中稳定期菌液，离心吸取细菌上清液80μL与20μL 5×Loading buffer混匀，100℃处理5 min，进行SDS-PAGE后，将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，与α-溶血素抗体(1∶5 000)孵育，4℃过夜，TBST洗涤3次每次5 min，再用HRP标记的二抗(1∶8 000)孵育1 h，再用TBST洗涤3次，加ECL暗室孵育2 min后，用全功能成像仪进行成像。
1.2.5荧光定量PCR试验
取1.2.3节中稳定期的菌液，参照SAMBANTHAMOORTHY等的方法提取总RNA。离心(4 500 r/min，5 min，4℃)，弃去上清液，收集菌体，重悬于含100μg/mL溶葡萄球菌酶的TES缓冲液中，37℃静置10 min。于波长为260 nm处测样品的吸光值，检查RNA的质量、完整性和浓度。按照试剂盒说明书，将RNA反转录成为cDNA。荧光定量PCR所用引物见表1。在Real-Time PCR扩增仪中进行扩增。反应体系为25μL，循环参数为：95℃变性30 s，95℃5 s，55℃30 s，72℃40 s，40个循环。采用ΔΔCt法分析基因的相对表达水平。
| 基因 (gene) | 引物 (primers) | 序列 (sequences) |
|---|---|---|
| 16S rRNA | 16S rRNA sense | 5′-GCTGCCCTTTGTATTGTC-3′ |
| 16S rRNA | 16S rRNA antisense | 5′-AGATGTTGGGTTAAGTCCC-3′ |
| hla | hla sense | 5′-TTGGTGCAAATGTTTC-3′ |
| hla | hla antisense | 5′-TCACTTTCCAGCCTACT-3′ |
| RNAIII | RNAIII sense | 5′-TTCACTGTGTCGATAATCCA-3′ |
| RNAIII | RNAIII antisense | 5′-CGGAAGGAGTGATTTCAATGG-3′ |
表1荧光定量PCR引物
1.2.6细胞毒性试验
培养人肺癌上皮癌细胞A549，用无菌PBS缓冲液冲洗涤细胞3次，然后用培养基调整细胞密度为2.0×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，37℃培养12~24 h。移除细胞培养基，然后加入含有不同浓度百里香酚的USA300细菌混悬液(USA300混悬于无双抗的DMEM培养基中)，每孔100μL，37℃培养6 h。Live/Dead试验：按照说明书加入Live/Dead试剂将细胞染色，再使用激光共聚焦显微镜进行染色并拍照。LDH试验：按照说明书加入Cytotoxicity Detection Kit试剂进行孵育，在波长为490 nm处检测吸光值，计算LDH的释放量。
1.2.7统计分析
每个试验均单独重复3次，数据以“mean±SD”表示；用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间进行Student’s t-test检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2.结果与分析
2.1百里香酚对金葡菌的抗菌活性
百里香酚和苯唑西林对金葡菌USA300的MIC分别为256μg/mL和64μg/mL，表明百里香酚对耐药性金葡菌有一定的抗菌活性。
2.2百里香酚在亚抑菌质量浓度下对金葡菌USA300生长的影响
在金葡菌USA300和百里香酚共培养体系中，百里香酚的质量浓度分别为0、4、8、16和32μg/mL，并测试了对金葡菌生长的影响。结果表明：百里香酚在这些质量浓度下对金葡菌USA300的生长没有影响(图1)。
图1不同质量浓度的百里香酚对金葡菌USA300的生长曲线
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