百里香酚MIC和生长曲线测定及对金葡菌Hla的作用机制（一）
摘要:目的α-溶血素在金黄色葡萄球菌(金葡菌)肺炎的感染过程中起着非常重要的作用，可作为治疗金葡菌肺炎的新靶标。因此，研究百里香酚对金葡菌α-溶血素表达的影响具有重要意义。方法测定最小抑菌质量浓度(MIC)和生长曲线并进行了溶血试验、蛋白免疫印迹分析、荧光定量PCR以及细胞毒性试验。结果百里香酚对金葡菌USA300的MIC为256μg/mL，亚抑菌质量浓度的百里香酚(32μg/mL)可下调金葡菌hla和RNAIII的转录水平，降低α-溶血素的表达，对溶血素介导的肺癌上皮细胞A549损伤具有?；ぷ饔谩＝崧郯倮锵惴泳哂谐晌滦涂菇鹌暇腥疽┪锏那绷?。
金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一种常见的条件性致病菌，它广泛地存在于人和动物体内。当宿主的非特异性免疫系统出现缺陷时，金葡菌可以感染宿主，引起多种疾病，给人和动物的健康造成严重的威胁。其中最典型的疾病就是金葡菌肺炎，具有高发病率、高致死率的特点。目前常采用抗生素治疗金葡菌肺炎，但是抗生素在使用过程中会对金葡菌的生长造成巨大的选择性压力，使菌群中耐药菌的比例上升，甚至出现多重耐药株，使得临床治疗效果下降甚至无效。因此，我们迫切需要新的药物或治疗策略来防治细菌感染尤其是耐药菌的感染。
抗毒力因子治疗策略是抑制细菌毒力因子的表达或其活性的一种治疗策略。这些毒力因子通常是细菌生长的非必需蛋白，以此为目标进行特异性干预，不会对细菌的生存带来选择性压力，因而不易产生耐药性而受到广泛关注。α-溶血素(Hla)是金葡菌的一种重要的毒力因子，在金葡菌感染肺部的过程中起着关键性作用。因此，Hla可以作为一种新的抗金葡菌肺炎的潜在靶标。
百里香酚(thymol)又名麝香草酚，是一种主要从唇形科植物中提取的单萜酚，为伞花烃的衍生物，与香芹酚互为同分异构体。百里香酚具有多种药理活性，如抗氧化、抗寄生虫、抗菌、调节免疫和促生长等。我们通过体外溶血实验模型筛选药物时，发现百里香酚具有抑制菌上清溶血的作用。本研究首先进行MIC和生长曲线的测定，然后通过蛋白免疫印迹和荧光定量PCR试验来探讨百里香酚对金葡菌Hla的作用机制，再通过细胞毒性试验研究百里香酚对金葡菌Hla介导的肺癌上皮细胞A549损伤的?；ぷ饔?，为百里香酚治疗金葡菌肺炎提供理论依据。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和细胞株
金葡菌菌株USA300和人肺癌上皮细胞A549(ATCC CCL 185)购于美国模式培养物集存库(ATCC)。
1.1.2主要试剂
百里香酚(HPLC 98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；TSB培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)；α-溶血素多克隆抗体和溶葡萄球菌素(Sigma公司)；羊抗兔二抗(Solarbio公司)；PVDF膜(Pall公司)；Super ECL Plus超敏发光液(Thermo fisher公司)；Qiagen RNeasy Maxi column(Qiagen公司)；反转录试剂Takara RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0和荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex Taq TM(Takara公司)；Cytotoxicity Detection Kit(LDH，Roche公司)；live/dead(green/red)reagent(Invitrogen公司)。
1.2方法
1.2.1百里香酚对金葡菌最小抑菌质量浓度(MIC)的测定
按照临床与实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的倍比稀释法测定百里香酚对金葡菌的最小抑菌质量浓度，苯唑西林作为对照组。
1.2.2百里香酚在亚抑菌质量浓度下对金葡菌USA300的生长曲线的测定
将金葡菌USA300过夜培养后，进行扩大培养，待金葡菌生长到OD600 nm=0.3时，加入不同量的百里香酚使其质量浓度分别达到0、4、8、16和32μg/mL，隔一段时间测定菌液OD600 nm值。