清开灵注射液对金葡菌生长代谢的抑制作用（二）
摘要:通过研究清开灵注射液对金葡菌生长代谢的影响，探索建立基于生物活性图谱的清开灵注射液的质量评价方法。本研究采用微量量热法，考察药物作用于金葡菌的生物热效应;对所测得的热输出曲线进行拟合，获得系列热动力学参数，对比分析各项热动力学参数及热输出曲线。结果显示，在一定范围内(0~5.00%)，随清开灵剂量增加，金葡菌生长曲线呈“下降”趋势且指数生长期后延;其热动力学参数T1、T2、k1、P1、P2、I均与清开灵剂量呈现线性关系。清开灵注射液对金葡菌的半数抑菌量为3.26%，最佳抑菌量为5.47%;各类不同的清开灵注射液样品作用下的金葡菌生长曲线存在不同程度差异。实验结果表明，清开灵注射液对金葡菌生长具有较强的抑制作用，通过微量量热法研究，可对清开灵注射液的质量一致性进行初步评价。
清开灵注射液是传统名方“安宫?；仆琛钡母牧技列停傻ㄋ帷⒄渲槟?粉)、猪去氧胆酸、栀子、水牛角(粉)、板蓝根、黄芩苷、金银花8味中药组成，成分复杂。清开灵主要用于热病、神昏、中风偏瘫、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、脑血栓形成、脑出血等。但是，随着清开灵注射液临床应用日益广泛，其引发的不良反应也时有报道。尽管目前针对清开灵注射剂质量评价也发展了许多基于化学成分的方法，但由于未直接与生物活性相关联，目前尚无有效控制质量一致性与稳定性的方法进入实际应用。
目前，在中药质量控制与评价研究中，生物评价已成为发展方向与热点之一。国家食品药品监督管理局(SFDA)针对已上市的中药注射剂明确要求:“建立生物活性检测方法，以弥补目前检验指标仅仅能控制已知成分的不足，从生物活性角度控制药品的质量?！痹谧⑸湟褐柿科兰厶逑抵幸肷锲兰鄯椒ň哂衅溲芯壳熬?。现代药理研究表明，清开灵注射液主要有解热镇静、抗菌、治疗脑缺血、抗凝促溶、免疫调节等作用。临床上，清开灵注射液常用于热病、急性上呼吸道感染及肺炎等，这与清开灵注射液具有良好的抗菌作用密不可分。微量量热法，作为一种快速非侵入性的方法，近年来被广泛应用于对物质抗菌能力的考察。结合课题组前期研究工作，本文采用微量量热法考察清开灵注射液对金葡菌生长代谢行为的影响，并对其抑菌作用参数进行比较和评价。
材料与方法
仪器:LKB-2277生物热活性检测系统,LKB-2132蠕动泵(瑞典Thermometric公司)。
药品与试剂:清开灵注射液样品共6批，由具代表性的两大生产厂家(BZY、SXTH)提供，各提供3批,样品批号分别为:811601、712604A、710510A和070930、071120、071219。
实验材料:金葡菌Staphylococcus aureus(武汉大学中国典型培养物保藏中心,CCTCC AB910393)。
培养基配制:LB培养基:取蛋白胨胨10.0 g,酵母粉5.0 g,氯化钠5.0 g,加蒸馏水至1 L,调节pH至7.0~7.2,分装后于121°C高压蒸气灭菌20 min,置4°C备用。
生长热功率输出曲线采集:采用停流法检测。系统温度设定为37℃，测定前分别用适量0.1mol·L氢氧化钠、0.1mol·L-盐酸、75%乙醇溶液和无菌水清洗管道和流通池，待仪器获得稳定基线后，用蠕动泵以50mL·h-l的流速，将菌液和清开灵注射液混合液泵入微量量热仪中;当样品充满流通池后停泵，启动采集卡开始采集数据，跟踪记录流通池内细菌生长的产热曲线(P-t曲线)，当产热曲线数据重新回到基线后，实验结束。
样品对金葡菌生长代谢影响测定:根据实验设计，将一定量的清开灵注射液加入到接种了金葡菌的培养液中，使最终菌悬液菌浓度为2x106CFU·mL-1振荡混匀，以备进样。整个过程为无菌操作。
结果
1金葡菌的生长热功率输出曲线
图1是37℃下，停流法测定的金葡菌完整代谢曲线。曲线a(P-t曲线)是所测定的细菌生长曲线，可以分成4个阶段:I停滞期、II指数生长期、III稳定期和IV衰亡期。分别对应于细菌对培养基中不同营养成分的利用情况及不同的代谢过程，与传统方法测定的细菌代谢曲线相似。曲线b(lnP-t曲线)则显示了线性拟合后细菌代谢热功率输出随时间的变化特征。
根据微生物生长代谢的特征和化学动力学、热动力学原理,建立了多种基于细菌细胞的热动力学模型,其中以指数模型最为常用。根据细菌生长指数模型,在细菌生长过程中的指数生长期,其产热功率Pt与生长速率常数k有如下关系:
Pt=P0exp(k t)或ln Pt=ln P0+k t
式(1)中的Pt就是产热曲线中指数生长期内t时刻的输出热功率,将图谱的指数生长期Pt、t值代入公式(1)中，进行线性拟合可得金葡菌的生长速率常数k值。