基于生长速率法评估植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌抑制效果（二）
1.6抑菌物质性质
1.6.1温度稳定性
将植物乳杆菌Bx6-2的上清液分别在40、50、60、70、80、90°C水浴中加热10 min，以甜瓜疫霉菌作指示菌，未处理的Bx6-2上清液作对照，计算相对抑菌率。
相对抑菌率=处理组的抑菌率/对照组的抑菌率*100%
1.6.2不同pH下的抑菌效果
用1 mol/L的NaOH和1 mol/L HCl溶液分别将植物乳杆菌Bx6-2的上清液pH调为3.0、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0，以甜瓜疫霉菌作指示菌，未处理的Bx6-2上清液作对照，按1.5所述的方法测定其抑菌率。
1.6.3排除乳酸对抑菌活性的影响
以不加发酵液的V8培养基作为空白培养基；加发酵液的V8培养基作为对照培养基1号；加入pH值与发酵液相同的乳酸溶液的V8培养基作为对照培养基2号；用高效液相色谱法测植物乳杆菌Bx6-2发酵液中乳酸的含量，加入相同含量的乳酸溶液的V8培养基作为实验培养基。以甜瓜疫霉菌作指示菌，按1.5所述方法测定其抑菌率。
1.6.4蛋白酶对抑菌活性的影响
将植物乳杆菌Bx6-2的上清液过0.22μm膜，分别加入酸性蛋白酶或中性蛋白酶(1mg/mL)，37℃水浴温育1h，以甜瓜疫霉菌作指示菌，按1.5所述方法测定其抑菌率。
1.6.5常温稳定性
将植物乳杆菌Bx6-2的上清液经0.22μm膜过滤，分别在常温下放置5、10、15、20d，以甜瓜疫霉菌作指示菌，按1.5方法测定其抑菌率。
2结果与讨论
2.1培养基对甜瓜疫霉菌菌丝生长的影响
甜瓜疫霉菌菌落形态因培养基种类不同而呈现明显的差异(图1)。甜瓜疫霉菌在不同培养基上培养4d后，菌落的直径大小不同。燕麦培养基上甜瓜疫霉菌的菌落直径最大，但菌丝较为稀疏；PDA培养基上的菌落形状不规则且边缘生长不均匀；V8培养基上菌落呈圆形，菌落边缘生长均匀且规则。为了使接入的菌块菌丝量基本一致，并且便于测量菌体直径，选择V8培养基作为培养甜瓜疫霉菌的培养基进行后续研究。
2.2植物乳杆菌发酵液对菌丝生长的抑制作用
植物乳杆菌发酵液对菌丝生长的抑制作用如图2所示。
由图2可以看出，植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌菌丝生长有很强的抑制作用，菌丝抑菌率随发酵液浓度的降低而减少。当发酵液浓度为8%时，植物乳杆菌Bx6-2的抑菌率达到了58%，而当发酵液浓度降至0.5%时，其抑菌率仍可达到30%。
2.3抑菌物质的性质
2.3.1温度稳定性
植物乳杆菌Bx6-2所产抑菌物质的温度稳定性实验结果如图3所示。由图3可知，植物乳杆菌Bx6-2所产的抑菌物质对热的稳定性较好，在60℃水浴中加热10min后，相对抑菌活性仍在65%以上。然而，当处理温度在60℃以上时，其抑菌效果明显下降。
2.3.2不同pH下的抑菌效果
植物乳杆菌Bx6-2的发酵液在不同的pH下，其抑菌效果也各不相同(图4)。当pH6.0时，抑菌效果达到最好，在过酸和碱性环境中其抑菌效果明显降低。因此，在发酵液中活性物质分离纯化和使用过程中应保持在pH6.0的弱酸性环境。
2.3.3排除乳酸对抑菌活性的影响
按照1.6.3的方法实验结果可知，植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌有抑制作用，而空白培养基与实验培养基均没有对甜瓜疫霉菌产生抑制作用。由此可知，乳酸不起作用，起抑菌作用的是其他发酵产物。
2.3.4蛋白酶对抑菌活性的影响
植物乳杆菌Bx6-2的发酵液经酸性蛋白酶和中性蛋白酶处理后，其抑菌活性均有所下降，但仍具有抑菌效果(表1)。经中性蛋白酶处理后的抑菌效果好于经酸性蛋白酶处理，说明植物乳杆菌Bx6-2产生的抑菌物质对酸性蛋白酶的敏感程度比对中性蛋白酶高。由此可见，植物乳杆菌Bx6-2的发酵液中蛋白质类物质起了一定的抑菌作用，但其抑菌现象可能是与其他物质共同作用的结果，还有待进一步研究。
表1蛋白酶对植物乳杆菌Bx6-2抑菌活性的影响
| 处理方式 | 菌落直径/cm | 抑菌率/% |
| 空白 | 6.93±0.06 | |
| 对照 | 4.60±0.10 | 33.6 |
| 酸性蛋白酶 | 5.40±0.14 | 22.1 |
| 中性蛋白酶 | 4.83±0.06 | 30.3 |
注：空白表示培养基中不加发酵液，对照表示培养基中加发酵液。
2.3.5常温稳定性
由图5可以看出，随着时间的增加，植物乳杆菌Bx6-2的抑菌活性有不同程度的下降。在常温下放置10d后，植物乳杆菌Bx6-2发酵液的抑菌活性仍保留在70%以上。放置15d以上，抑菌活性明显下降，仅能达到原抑菌活性的20%左右。由此可见，植物乳杆菌Bx6-2产生的抑菌物质在常温下一定时间范围内稳定性较好。
3结论
植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌有抑制作用，而且随着发酵液浓度的增加其抑菌效果也增加。通过对发酵液性质的研究发现，该菌发酵液中的抑菌物质对热的稳定性较好，在60℃水浴中加热10 min后，相对抑菌活性仍在65%以上。pH、蛋白酶类对其抑菌效果均有不同程度的影响。当pH为6.0时，抑菌效果达到最好，在过酸和碱性环境中其抑菌效果明显降低。而植物乳杆菌Bx6-2产生的抑菌物质对酸性蛋白酶的敏感程度比对中性蛋白酶高。在常温下放置10d后，植物乳杆菌Bx6-2发酵液的抑菌活性仍保留在70%以上，说明在常温下一定时间范围内其抑菌活性稳定。同时还发现发酵液中乳酸并不起抑菌作用。
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