不同保存条件、培养基对淋病奈瑟菌存活率的影响——摘要、材料与方法
摘要： 目的 优化淋病奈瑟菌（简称淋球菌）的分离培养及保存方法。方法 采用自制淋球菌选择性培养基与7种商品化淋球菌选择性培养基［淋球菌分离培养板、淋球菌（T-M）选择培养基、巧克力平板（淋球菌）、淋球菌选择培养基、MTM琼脂平板、一次性GC琼脂培养基、淋球菌琼脂平板］分别培养5株质控菌（1号淋球菌、2号淋球菌、黏液奈瑟菌、粪肠球菌、混合菌），评估培养基效能。通过烛缸内、外培养法培养16株淋球菌，筛选CO2依赖型菌株；评估4种自制淋球菌保存液（10%二甲基亚砜小牛血清、10%甘油小牛血清、20%甘油脑心浸液及30%甘油胰酶大豆肉汤）保存淋球菌的效果；观察淋球菌在冻干和未冻干状态下的存活情况。
结果 5株质控菌株在不同的淋球菌商品化培养基上生长效果存在差异，1号淋球菌在自制培养基和MTM琼脂平板上生长的菌落大且数量多，优于其他6种培养基；2号淋球菌在7种商品化培养基中生长情况均不如自制培养基；7种商品化培养基对黏液奈瑟菌生长均有抑制作用，其中自制培养基、巧克力平板（淋球菌）、MTM琼脂平板、一次性GC琼脂培养基、淋球菌琼脂平板能完全抑制其生长；淋球菌（T-M）选择培养基能完全抑制粪肠球菌的生长；混合菌在自制培养基淋球菌分离培养板、淋球菌（T-M）选择培养基、巧克力平板（淋球菌）、MTM琼脂平板及一次性GC琼脂培养基等培养基上分离效果较好。在有CO?环境下，16株淋球菌均呈现出良好的生长状态；无CO?条件下，11株淋球菌生长受到明显的抑制。4种保存液在-70 ℃条件下保存效果未见差异，保存12个月时均可见培养菌落融合成片；在-20 ℃条件下，30%甘油胰酶大豆肉汤保存效果最好，6个月时仍有少数存活；10%二甲基亚砜小牛血清保存效果最差，2周时仅部分存活。
未冻干的淋球菌在不同温度（4 ℃、-18 ℃、-29 ℃、-70 ℃和液氮）下的保存时间存在差异，4 ℃保存第4天即无淋球菌存活；冻干后的淋球菌在4 ℃保存6个月仍可存活（菌落融合成片）。结论 自制淋球菌选择性培养基对淋球菌的培养及分离效果优于商品化淋球菌选择性培养基；少量的CO2可以促进淋球菌生长；超低温及冻干保存淋球菌可以提高淋球菌存活时间，4 ℃冻干保存是最经济有效的长期保存方案。
引言
淋病是我国法定报告的乙类传染病，也是我国目前重点防控的性传播疾病之一。该病的病原体淋病奈瑟菌（简称淋球菌）的培养受多种因素影响，包括规范的标本取材、培养基的质量、适宜的培养温度以及一定浓度的CO?。淋球菌除对培养条件要求苛刻，其菌株的长期保存也面临许多困难，目前常用的脱脂牛奶保存法存在保存效果不稳定、存活时间短等问题，给淋球菌耐药监测及其相关科研工作带来诸多不便。虽然冷冻干燥法被认为是细菌保存的最佳方法，但其操作复杂，费时费力且设备昂贵，在淋球菌保存中的实际效果需要进一步验证[5]。本研究旨在系统评估不同保存条件对淋球菌存活率的影响，为淋球菌的运输、标本库的建立及标准化管理提供科学依据。
一、材料与方法
1.菌株来源：
4株淋球菌参考菌株，编号ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL，来自世界卫生组织西太区。5株质控菌株：1号、2号为淋球菌，编号ATCC49226、WHOG，来自世界卫生组织西太区；黏液奈瑟菌（Neisseria mucosa），编号ATCC19695，粪肠球菌（Enterococcus faecalis），编号ATCC29212，来自美国典型菌种保藏中心；混合菌含1株淋球菌（编号ATCC49226）和1株粪肠球菌（编号ATCC29212）。16株淋球菌临床分离株，编号分别为NJ08-91、NJ08-92、NJ08-93、NJ08-94、NJ08-99、NJ08-100、NJ08-101、NJ08-102、NJ08-104、NJ08-105、NJ08-106、NJ08-107、NJ08-112、NJ08-117、NJ08-118、NJ08-136，来自中国医学科学院皮肤病医院性病科。
2.培养基及保存试剂：
自制淋球菌选择性培养基，成分为3.6%的GC基础粉、0.4%的VCN抑制剂（英国Oxoid公司）、2%的Vso-Vitalex增菌剂（英国Oxoid公司）、2%的血红蛋白粉。7种商品化淋球菌选择性培养基分别为淋球菌分离培养板（珠海市银科医学工程股份有限公司）、淋球菌（T-M）选择培养基（南京迪景生物制品有限公司）、巧克力平板（淋球菌）（广州市景泉微生物科技有限公司）、淋球菌选择培养基（江门市凯林贸易有限公司）、MTM琼脂平板（上海伊华医学科技有限公司）、一次性GC琼脂培养基（天津市金章科技发展有限公司）、淋球菌琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司）。冻存基质：脱脂牛奶、甘油、二甲基亚砜、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、脑心浸液及胰酶大豆肉汤（美国BD公司）；冻干?；ぜ粒和阎Ｄ?。
3.培养基性能评估：
从4℃冰箱取出5株质控菌株，各加300μl无菌生理氯化钠溶液后混匀，用移液器分别取出10μl菌液接种到经过预温的自制淋球菌培养基及7种商品化淋球菌选择性培养基，并作四区划线培养，置于36℃培养箱中烛缸培养36 h，记录菌落形态，包括菌落大小、透明度、纯度及杂菌抑制情况。
4.CO?依赖型实验：
从-70℃冰箱中取出4株淋球菌参考菌株（ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL）及12株临床分离株（NJ08-92、NJ08-94、NJ08-99、NJ08-100、NJ08-101、NJ08-102、NJ08-104、NJ08-105、NJ08-106、NJ08-112、NJ08-117、NJ08-118），分别取出10μl标本平行接种于2块淋球菌培养基，置于烛缸内（含CO?）和烛缸外（不含CO?）的培养箱中，36℃培养36 h，观察两组菌落生长情况。依据全国临床检验操作规程判定菌落生长情况，“+”：1～10个菌落（稀疏生长）；“++”：11～100个菌落（中等生长）；“+++”：>100个菌落，但未融合（密集生长）；“++++”：菌落融合成片（无法计数）。
5.保存液效果比较：
4种淋球菌保存液分别为10%二甲基亚砜小牛血清（二甲基亚砜与小牛血清1:9）、10%甘油小牛血清（甘油与小牛血清1:9）、20%甘油脑心浸液（3.7%脑心浸液与甘油4:1）、30%甘油胰酶大豆肉汤（专利申请号：2025107655801），根据各自特点进行配制，将待测的4株参考菌株（ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL）和4株临床分离株（NJ08-91、NJ08-93、NJ08-107、NJ08-136）分离纯化后，制成1×10?CFU/ml菌悬液，置于不同保存液中，各分装数支，分别置于-20℃和-70℃的冰箱中，定期取出10μl接种于淋球菌培养基中，36℃培养36 h，观察菌落生长情况。
6.保存方法效果比较：
参考菌株WHOJ分离纯化后，制成1×10?CFU/ml的菌悬液，置于灭菌的10%脱脂牛奶中，分装数支，将冻干和未冻干的淋球菌分别置于4℃、-18℃、-29℃、-70℃和液氮环境中保存，定期分别取出10μl接种于淋球菌培养基36℃培养36 h，观察淋球菌的存活情况。
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