基于生长速率法优化放线菌发酵培养基和发酵条件（三）
2.5放线菌R2A-77菌株发酵条件的优化
2.5.1 pH
指状青霉生长圈随发酵初始pH的增大呈先缓慢减小后增大的趋势。pH为7.0时，指状青霉的生长圈最小，生长圈平均直径为10.27 mm；发酵初始pH低于7.0时，菌圈呈现出逐步扩张的态势；而随着pH不断增大，指状青霉的生长圈随之增大。说明放线菌R2A-77菌株在强酸或强碱条件下，并不适宜产生具有活性的物质。因此，确定pH为7.0作为放线菌R2A-77菌株发酵的最优初始pH。
2.5.2发酵时间
指状青霉生长圈随发酵时间的延长呈先下降后上升的趋势。发酵至第6天时指状青霉生长圈最小，生长圈平均直径为10.85 mm。故发酵时间选用6 d作为放线菌R2A-77菌株的最优发酵时间。
2.5.3接种量
指状青霉生长圈随放线菌R2A-77接种量的增加呈先降后升的趋势。当接种量为3%时，指状青霉的生长圈最小，生长圈平均直径为10.75 mm；其他接种量均导致放线菌R2A-77菌株的抑菌活性下降。在接种量逐渐增加的初期阶段，放线菌R2A-77菌株产生的代谢物含量随之上升，使得抑菌活性逐渐增强；接种量大于3%，发酵液中的营养物质难以满足过量细胞的需求，细胞活性成分的合成过程受到限制，最终导致抑菌活性降低。因此，确定3%作为放线菌R2A-77菌株的最优接种量。
2.5.4装液量
指状青霉的生长圈随装液量的增加呈先降后升的趋势。当250 mL锥形瓶的装液量为150 mL时，指状青霉的生长圈最小，生长圈平均直径为9.83 mm；在装液量逐渐增加的初始阶段，由于锥形瓶内营养物质随之增多，为放线菌R2A-77菌株提供了更丰富的原料，使其产生抑菌活性物质的能力增强，然而，随着装液量的进一步增加，锥形瓶内的气体空间被压缩，氧气含量逐渐减少难以满足放线菌R2A-77有氧呼吸的需求，当氧气不足时，放线菌R2A-77的生长与代谢活动受到抑制，进而影响其产生抑菌活性物质的能力。因此，确定放线菌R2A-77菌株的最优装液量为150 mL/250 mL。
2.6验证试验
综合以上优化结果，以10 g/L蔗糖、35 g/L大豆蛋白胨、1000 mL蒸馏水的改良MS发酵培养基，以发酵初始pH为7.0，接种量为3%，装液量为150 mL/250 mL，发酵6 d，对发酵液的抑菌活性进行测定，结果表明，优化后的发酵液抑菌率为98%，优化前的抑菌率为83%。
3讨论
放线菌是一个丰富的微生物类群，已鉴定出至少有180个属2000多个种。而放线菌合成抗生素物质是人们关注的焦点之一，据研究统计，70%的抗生素来自放线菌，50%来自链霉菌。除了产生抗生素外，放线菌发酵产物在农业病虫害防治及医学抗真菌药物研制方面也是重要材料。国内外学者通过对多种链霉菌进行了深入研究。例如，王宁等通过形态学观察、生理生化特征以及16S rRNA序列分析等手段成功鉴定出苹果树腐烂病生防菌株A144为娄彻氏链霉菌；蒋冬阳等筛选到对引起大豆根腐病的多种病原菌以及大豆白绢病菌、草莓灰霉病菌、稻瘟病菌等均有很好抑制作用的弗吉尼亚链霉菌IRHB 47；HAMED等从海洋沉积物中分离到1株对白色念珠菌ATCC 10231具有极强拮抗活性的放线菌菌株MK388207，经鉴定，该菌株为链霉菌属。而较少有关链霉菌防治指状青霉的研究报道。本研究从广东省湛江市廉江九洲江红橙园红橙植株的根部土壤中分离的放线菌R2A-77属链霉菌，对指状青霉具有良好的抑制作用。
已有研究表明，优化活性菌株的发酵培养基和发酵条件可提升抑菌活性物质的作用。刘一贤等通过研究表明，发酵培养链霉菌17-7菌株的最适合碳源为玉米粉10 g/L和葡萄糖10 g/L，最适氮源为大豆粉25 g/L和酵母粉2 g/L。刘芳等优化的链霉菌SZF-179最适发酵培养基中的碳源为麦芽糖15.86 g/L和土豆淀粉10.00 g/L，氮源为酵母膏8.15 g/L。由此可知，不同的链霉菌在发酵中会受碳源、氮源的种类及其浓度的影响。此外，适当的发酵初始pH、发酵时间、发酵装液量和接种量能促进发酵活性物质的产生。例如，对多种植物真菌具有拮抗作用的链霉菌FIM-B0711的最佳发酵条件：pH为7.0，接种量为3%，装液量为30 mL/250 mL，发酵时间为96 h，在该发酵条件下发酵物产量提升了57.69%。高加索链霉菌（S.ciscaucasicus）SS9-1的最佳发酵条件：装液量为150 mL，接种量为3%，pH为8.0，发酵时间为7 d，在该发酵条件下发酵物对番茄灰霉病的拮抗效果提高到98.43%。因此不同的链霉菌有不同的营养要求和发酵条件。本研究对放线菌R2A-77菌株的发酵培养基与发酵条件进行优化。通过优化，该菌株的抑菌率提升15%，抑菌率达到98%。
本研究的放线菌R2A-77与前期研究的放线菌R2A-15同属于链霉菌，但是16S rRNA基因序列不同，通过在NCBI上进行blastn比对，发现2株菌的16S rRNA基因序列相似性仅为95.29%。在进化关系上，与放线菌R2A-77最相似菌株为S.salinarius SS06011，与放线菌R2A-15最相似菌株为S.virginiae NRRL ISP-5094。放线菌R2A-15在MS培养基上形成的菌落较大，气生菌丝呈粉色，基内菌丝呈米黄色，表型特征明显与放线菌R2A-77不同。
本研究采用生长速率法测定放线菌R2A-77发酵液对靶标菌的抑菌活性，筛选获得的最优发酵培养基仅含蔗糖、大豆蛋白胨和蒸馏水，而放线菌R2A-15的最优发酵培养基包含玉米面、酸水解酪蛋白、碳酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钠和蒸馏水，表明放线菌R2A-77的发酵培养基原料种类更简单、成本更低廉。但在发酵条件上放线菌R2A-15的发酵时间仅需37.54 h，摇瓶装液量减少至100 mL/250 mL，因此其发酵效率更高。研究表明，放线菌R2A-15和放线菌R2A-77对指状青霉均有较高的抑菌活性，因此，这2株放线菌均具有重要的研究价值和应用潜力。后续研究重点将聚焦于其发酵活性物质的分离与鉴定。
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