小龙虾贮藏过程中优势腐败菌筛选、及微生物菌群结构分析（二）
1.3.3腐败菌单菌落的分离及纯化
将鲜活小龙虾碎冰猝死后，置于4℃条件下贮藏，选择贮藏腐败终点的小龙虾样品按照1.3.1节中的方法制成菌悬液，进行10倍梯度稀释，选择合适稀释倍数菌液均匀涂布于NA、CFC培养基、TSI培养基、BP培养基、RYAN培养基，置于30℃恒温培养箱中孵育48 h，在选择性培养基上挑选不同颜色、形态的菌落，挑取单菌落并进行2～3次划线纯化，并于-80℃保存。
1.3.4腐败菌菌种的鉴定
1.3.4.1分子生物学鉴定及系统发育树的构建
腐败菌接种于营养肉汤培养基中孵育至对数稳定期，提取细菌DNA并进行16S rDNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，最终产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。将测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）与Gen Bank库中进行BLAST序列比对。选取相似性在98%以上的菌株序列，利用MEGA 7.0.26软件中的邻近法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。
1.3.4.2生理生化实验鉴定
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等，应用一系列生理生化实验，将筛选得到的腐败菌菌种作进一步鉴定。
1.3.5高通量测序法测定小龙虾中优势腐败菌
选取在4℃贮藏0 d（鲜样期）、8 d（腐败初期）、12 d（腐败中期）、16 d（腐败末期）的小龙虾，取虾肉进行制样，得到菌悬液。提取样品菌悬液的DNA，并进行PCR扩增，将检测合格后的DNA样品送至上海凌恩生物科技有限公司进行高通量测序。
1.4数据处理
每组实验设置3次平行，结果用平均值±标准差表示。利用SPSS 17.0软件对数据进行差异显著性分析，差异显著性标准为P＜0.05，采用Origin 7.5软件作图。
2结果与分析
2.1小龙虾4℃贮藏期间菌落总数及TVB-N含量变化
图1 4℃贮藏期间小龙虾菌落总数的变化
小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。下同。
水产品及肉类食物容易在微生物及酶的作用下发生蛋白质分解、脂质氧化等生化反应，进而引起腐败变质。因此可以通过测定小龙虾肉中的菌落总数来初步判断小龙虾被细菌污染及腐败的程度，反映虾的品质。由图1可知，小龙虾在4℃贮藏过程中的菌落总数随着时间的延长呈现上升的趋势，贮藏0～2 d，其增长趋势比较缓慢，说明小龙虾并没有发生明显的腐败。而贮藏2～10 d，菌落总数急剧增加，说明小龙虾在这个过程中发生严重腐败。贮藏6 d左右，小龙虾菌落总数超过无公害水产品安全限值（6.0（lg（CFU/g））），表明此时小龙虾腐败严重，到达了其货架期的终点。江杨阳等对江苏盱眙产地小龙虾研究发现，菌落总数也在6 d超过6.0（lg（CFU/g））。除此之外，Li Yan等发现，南美白对虾同样在贮藏6 d菌落总数超过了限值。本实验中的小龙虾在贮藏10 d之后，菌落总数不再明显增长，逐渐进入稳定期。
图2 4℃贮藏期间小龙虾TVB-N含量的变化
TVB-N是在微生物和酶的双重作用下分解蛋白质等含氮物质产生的生物胺、氨等挥发性碱性代谢物质的总称，其含量是评价水产品及肉类品质最重要的指标，是判断水产品新鲜程度及是否腐败变质的重要因素。由图2可知，在整个贮藏过程中，TVB-N含量整体呈现上升趋势，前期增长比较缓慢，在贮藏后期随着菌落总数的快速增长、腐败加剧，导致了TVB-N含量增加速率加快。小龙虾TVB-N含量在贮藏6 d时已达43.28 mg/100 g，与秦求思等测得的4℃贮藏6 d的鹰爪虾TVB-N含量相近，超过GB 10136—2015《食品安全国家标准动物性水产制品》中所规定的淡水水产品TVB-N含量限定值30 mg/100 g，并且伴随强烈的动物腐烂的氨臭味。这与小龙虾菌落总数超过限值的贮藏时间相一致，表明TVB-N含量变化与菌落总数密切相关，结合2个指标结果综合分析得出，小龙虾在贮藏6 d时已经腐败。
2.2优势腐败菌单菌落的分离
选择在4℃贮藏至腐败的小龙虾进行平板涂布、划线，根据菌落形态及颜色差异在5种固体培养基上分离纯化出10株细菌，编号依次为B1～B10。10株细菌菌落形态及颜色具体见表1。
表1所筛选腐败菌菌落的形态特征
2.3腐败菌菌种的鉴定
2.3.1腐败菌菌株分子生物学鉴定
对菌株B1～B10进行16S rDNA测序后，登录NCBI网站进行BLAST序列比对，并选取Max ident在98%以上的菌株，构建系统发育树，根据系统发育树（图3）及测序对比结果，将B5、B6、B7、B9及B10细菌定种，分别为中间气单胞菌（Aeromonas media）、巨型球菌（Macrococcus caseolyticus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）及缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）。
图3基于16S rDNA构建的系统发育树
2.3.2生理生化实验鉴定
根据测序结果及系统发育树已对部分菌株定种，对仍无法定种的几种腐败菌进行生理生化实验，结果如表2所示，最终确定菌株B1～B4及B8的种类，分别为普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。
表2部分菌株生化鉴定实验结果
注：-.阴性；+.阳性；/.未进行实验。
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