基于可培养技术的古象牙病害微生物分离鉴定与抑菌剂筛选评价（三）
2.3菌株系统发育分析
4株细菌经16S rRNA序列测定后，将序列提交至GenBank数据库(登录号OL518985-OL518988)，并通过在NCBI上对测定序列进行BLAST比对分析，选取相似度最高的菌株，确定菌株属、种，构建系统发育树(图5)。结果表明古象牙表面分离获得的4株可培养细菌分属于红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞属(Pseudomonas)、贪铜菌属(Cupriavidus)4个属。
29株真菌经ITS序列测定后，将序列提交至GenBank数据库(登录号OL604334-OL604362)，并通过在NCBI上对测定序列进行blast比对分析，选取相似度最高的菌株，确定菌株属、种(表2)，构建系统发育树(图6)结果显示两种古象牙残片表面所分离获得的可培养真菌并无明显差别，但XY51-1残片上的真菌种类相对丰富，且在XY51-2残片上分离的真菌属大部分在XY51-1残片上皆有发现，两种古象牙残片可培养真菌种类的差异可能与其出土时间有关，XY51-1残片相较于XY51-2残片出土时间更晚，其暴露于环境中的时间更久，受环境中空气、水分、温度等的影响更大，这可能是导致其表面真菌种类更丰富的重要原因。从两种古象牙残片表面共分离出3个门16个属的真菌，其中子囊菌门(Ascomycota)包含7个属，分别为枝胞属(Cladosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、土赤壳属(Ilyonectria)、黑孢霉属(Nigrospora)、黑陷球壳属(Trematosphaeria)、曲霉菌属(Aspergillus)；担子菌门(Basidiomycotina)包含7个属，分别为田头菇属(Agrocybe)、鬼伞属(Coprinellus)、栓菌属(Trametes)、裂褶菌属(Schizophyllum)、拟层孔菌属(Fomitopsis)、蜡孔菌属(Ceriporia)、烟管菌属(Bjerkandera)；半知菌门(Deuteromycetes)包含2个属，为附球菌属(Epicoccum)、链格孢属(Alternaria)。
2.4细菌抑菌效果
将菌株接种于含有不同抑菌剂的MHA平板上置于30°C恒温培养24 h后，通过观察细菌生长状况可知，苯并咪唑抑菌效果最差，对除B6菌株外的3种菌株浓度到2048 mg/L也无抑菌效果，且菌落生长旺盛，所以在后续复配实验中将其淘汰。而其他3种抑菌剂对菌落都有不同程度的抑制作用，其中苯扎氯铵对分离菌株B6、B12、B13、B106的最小抑菌浓度分别为4、4、64、16 mg/L；三氯生对分离菌株B6、B12、B13、B106的最小抑菌浓度分别为2、0.5、256、0.5 mg/L(图7)；特泯菌对分离菌株B6、B12、B13、B106的最小抑菌浓度分别为1、8、2、2 mg/L(表3)?？杉?，除苯并咪唑外，苯扎氯铵、三氯生、特泯菌的抑菌效果均随着抑菌浓度的增加而增加，其中苯扎氯铵、三氯生、特泯菌能同时抑制4株供试菌的MIC值分别为64、256、8 mg/L。
综合各抑菌剂抑制供试细菌的MIC值，将苯扎氯铵、三氯生、特泯菌3种抑菌剂进行两两复配后观察其抑菌效果。将各抑菌剂能抑制所有供试细菌生长的最低浓度减半后进行两两复配，若能完全抑制供试菌株生长则继续对复配浓度减半，直至筛选出能抑制所有供试菌株生长的最低复配浓度。结果表明，抑菌剂的复配浓度分别为苯扎氯铵16 mg/L、三氯生64 mg/L、特泯菌2 mg/L时能完全抑制供试菌株的生长，其中组合苯扎氯铵和特泯菌复配浓度分别为16 mg/L和2 mg/L时效果最佳(表4)，说明抑菌效果不仅受抑菌剂浓度的影响，同时也与抑菌剂的组合有关。
2.5真菌抑菌效果
不同抑菌剂对各真菌的抑菌结果表明，苯并咪唑浓度达到2000 mg/L都不能完全抑制所有供试真菌的生长，抑菌效果最差。由于在试验过程中还发现苯并咪唑的母液浓度为20500 mg/L左右时，基本已经达到饱和浓度不能再提高，因此在后续复筛中不再使用。其余3种抑菌剂能够完全抑制所有供试真菌生长的浓度分别为苯扎氯铵8000 mg/L，制霉菌素和三氯生均为400 mg/L(图8)，说明不同抑菌剂对真菌的抑菌效果存在较大差异(表5)。
根据各抑菌剂对供试真菌的MIC值，采用二倍稀释法配置复配抑菌剂，接种供试菌株于不同复配浓度的PDA平板，置于25°C恒温培养5 d观察各菌株生长状况。结果表明，制霉菌素与苯扎氯铵分别按200 mg/L和4000 mg/L进行复配时，可完全抑制所有供试真菌的生长；而三氯生和制霉菌素的复配浓度均为200 mg/L时，除菌株A17不能抑制外，可抑制所有供试菌株的生长(表6)。
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