基于可培养技术的古象牙病害微生物分离鉴定与抑菌剂筛选评价（一）
摘要
为科学有效防控三星堆出土古象牙的微生物病害，采用可培养技术对三星堆出土古象牙残片表面滋生的细菌和真菌进行分离鉴定，并测定苯扎氯铵、苯并咪唑、制霉菌素、三氯生、特泯菌5种抑菌剂对微生物的最小抑菌浓度(MIC)，分析抑菌效果，确定科学的使用剂量。通过可培养方法从三星堆古象牙残片上分离出4株分属于4个属的细菌，分离出29株分属于3个门16个属的真菌，其中子囊菌门(Ascomycota)7个属、担子菌门(Basidiomycotina)7个属以及半知菌门(Deuteromycetes)2个属。抑菌结果表明，除苯并咪唑外，其他4种抑菌剂的抑菌浓度虽然存在差异，但在一定浓度范围内都能达到完全抑菌的效果。苯扎氯铵、三氯生、特泯菌能够抑制所有细菌生长的MIC分别为64、256、8 mg/L，在复配处理中，3种抑菌剂苯扎氯铵(MIC 16 mg/L)、三氯生(MIC 64 mg/L)、特泯菌(MIC 2 mg/L)两两随机复配均能达到完全抑菌效果；苯扎氯铵、三氯生、制霉菌素能够抑制所有真菌生长的MIC分别为8000、400、400 mg/L，在复配处理中，制霉菌素与苯扎氯铵MIC分别为200、4000 mg/L时复配能完全抑制所有供试真菌的生长?？杉?，三星堆出土古象牙表面分布着种类丰富的微生物，不同抑菌剂对不同种类微生物的抑制效果存在差异，复配抑菌剂的抑菌效果优于单一菌剂；结果可为三星堆出土古象牙微生物病害防治和古象牙?；すぷ魈峁┛蒲б谰?。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集
三星堆古象牙残片出土后被保存在垫有网状海绵的塑料盒子中保藏，以出土于K5坑表面滋生有微生物的古象牙残片样品为研究对象，采用无菌棉签对古象牙残片已长菌或出现明显色变的位置进行擦拭，并放置于无菌Eppendorf管中，保存于冰盒，立刻带回实验室进行后续研究。
1.1.2培养基及主要试剂与仪器
?培养基:PDA(potato dextrose agar)、TSA(tryptone soy agar)、MHA(Mueller-Hinton agar)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
?主要试剂:真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、PCR引物、琼脂糖、制霉菌素、苯并咪唑、三氯生、特泯菌，生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR mix,天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料Redgeld,BBI生命科学有限公司；无水乙醇，成都市科隆化学品有限公司；苯扎氯铵，成都贝斯特试剂有限公司。
?主要仪器:超景深显微镜VHX7000，日本基恩士KEYENCE公司；光学显微镜，ZEISS公司；冷冻离心机，Eppendorf公司；PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶成像仪，Bio-Rad公司；DKT200-4恒温金属浴，杭州米欧仪器有限公司；恒温培养箱，郑州生元仪器有限公司；96孔细胞培养板，BBI生命科学有限公司；oCelloScope 微生物生长曲线测量仪，丹麦Biosense公司。
1.2方法
1.2.1古象牙残片表面微生物观察
将装古象牙残片的塑料盒子直接放于超景深显微镜载物台上，于30x和200x的放大倍数下观察古象牙残片表面微生物形态并拍摄照片。
1.2.2菌株培养与纯化
分别采用TSA和PDA培养基分离古象牙表面滋生的细菌和真菌，将采集的样品在分离培养基上均匀涂布，每组重复3次。涂布后的PDA平板置于25°C恒温培养箱培养3-5 d，TSA平板置于28°C恒温培养箱培养2-3 d。待菌落长出后，挑取具有不同菌落特征的菌株进行纯化，并用斜面试管和甘油管进行菌种保藏。
1.2.3菌株形态观察及系统发育分析
?菌株形态学观察:将分离获得的细菌接种于TSA平板上28°C恒温培养24 h，挑取单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌株的显微形态；将真菌接种于铺有无菌玻璃纸(3 cm x 3 cm)的PDA平板上，25°C恒温培养5 d，观察菌落的颜色、大小、菌丝生长状况，并用剪刀剪取长有菌的一小块玻璃纸边缘在50%的乙醇中漂洗5 s后将有菌面朝上置于载玻片上，滴加棉兰染色液后盖上盖玻片，在光学显微镜下观察菌丝以及孢子形态。
?DNA提取及系统发育分析:采用Cui等的方法提取细菌的DNA，采用30μL反应体系，以16S rRNA的通用引物8-27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAAC GAACGCT-3')和1492-1523R(5'-TACGG CTACCTTGTT-ACGACTT CATCACCC-3')对DNA进行PCR扩增。将长满真菌菌丝的3 cm x 3 cm玻璃纸取出放置于2 mL的Eppendorf管中，用液氮快速冷冻研磨粉碎，用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒按照说明操作提取真菌DNA。采用30μL反应体系，以ITS的引物ITS1F(5'-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3')和ITS4R(5'-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3')对DNA进行PCR扩增。
PCR扩增产物送至杭州有康生物科技有限公司成都分公司进行测序，测序结果在NCBI中利用BLAST进行比对，找出与目标菌株同源性较高的16S rRNA/ITS序列，用MEGA7.0软件通过邻近法构建目标菌株的系统发育树，确定其分类地位。
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