梅花鹿体细胞航天诱变、细胞样品回收培养技术、生长曲线及核型特性（一）
摘要：本研究以自主研发的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）细胞培养技术进行了梅花鹿（Cervus nippon）体细胞的航天培养及生物诱变，并分析了其细胞在航天诱变后的生长曲线和核型特性。采用耳缘皮肤组织块贴壁培养的方法进行体细胞的原代培养；胰蛋白酶消化的方法完成细胞的传代培养；依照程序降温的方法完成细胞的冷冻保存；每天计数24孔板每孔的活细胞数并利用Excel 97-2003绘制出细胞的生长曲线，采用IBM SPSS Statistics 23统计软件回归分析程序中的非线性回归分析子程序Logistic曲线模型分析细胞生长曲线的拟合度；以常规染色体标本制备技术，利用细胞遗传工作站（AI）软件对梅花鹿体细胞的染色体核型进行分析。
实验结果表明，新开发的PVDF膜细胞培养技术可有效保持梅花鹿体细胞在太空飞行过程中的存活并成功回收、传代建系。通过细胞传代培养观察发现，该体细胞经航天诱变后保持正常的成纤维细胞特征，生长曲线呈“S”型，航天诱变组体细胞在培养4 d进入对数生长期，与对照组体细胞在培养2 d进入对数生长期相比其细胞增殖速度减慢。拟合生长曲线分析表明，航天诱变组细胞生长拟合度值与对照组相似，但细胞增殖拐点时间、拐点细胞量分析结果证明，航天诱变后的体细胞增殖速度减慢。核型分析显示，航天诱变梅花鹿体细胞染色体数保持2n=66，染色体形态正常，核型为66（XX），其中32对常染色体，1对性染色体。本研究建立了哺乳动物在航天运行条件下的细胞培养PVDF新技术，并分析了航天诱变对于梅花鹿细胞生物学特性变化的影响，为以后进行相关研究提供了基础信息和技术支持。
梅花鹿（Cervus nippon）主要分布在亚洲东部，是东亚季风区特产的珍贵经济动物之一，已列为国家Ⅰ级重点?；ひ吧铩Ｃ坊故粲诓溉楦伲∕ammdia）偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervide）花鹿属。在公元前14世纪至公元前12世纪中国就开始对野生梅花鹿进行驯养化利用，是世界上最早养殖梅花鹿的国家。我国作为目前世界上仅有的3个（美国、俄罗斯、中国）掌握返回式卫星技术的国家之一，近些年来在航天生物育种领域取得了一系列开创性研究成果。2016年4月6日凌晨升空的“实践十号”卫星，搭载了来自内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院提供的牛（Bos taurus）、绵羊（Ovis aries）、梅花鹿等大型动物和野生动物的体细胞（somatic cell）、精子（sperm）等材料，这是我国首次在太空进行大型动物航天生物诱变实验。
本研究以雌性梅花鹿体细胞为材料，开发了哺乳动物体细胞在太空的培养新技术，与对照组比较分析了航天诱导的梅花鹿体细胞的细胞生长、染色体变化等生物学特性，为动物的航天生物育种技术建立提供了基础资料和相关信息。本研究同时对于丰富我国动物品种资源库、提升梅花鹿产业竞争力具有重要战略性意义。
1材料与方法
1.1实验材料
2016年3月在内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院实验基地选取19月龄健康的雌性梅花鹿，编号为NCH32，剪取其耳缘皮肤组织用于实验。
1.2雌性梅花鹿NCH32成纤维细胞系的建立
剪取雌性梅花鹿NCH32的耳缘皮肤组织约1 cm2，用手术刀片剔除耳毛，并用含有青霉素和链霉素双抗的PBS清洗3次，24 h内送回实验室进行原代细胞建系培养。在超净工作台中，用75%酒精浸泡采取的组织样品30 s，再用Dulbecco磷酸盐缓冲液（Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS）（GIBCO公司）冲洗3次，用手术刀片剔除皮肤间的结缔组织，将其剪成1 mm3左右的小块，用无菌玻璃管将组织碎块均匀分布于培养瓶中，加入5 ml含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（GIBCO公司）的MEM-Alpha（1×）（α-MEM）培养液（GIBCO公司），在37.5℃、5%CO?的培养箱（RS Biotech 311）中倒置培养4~6 h后，正置培养瓶继续培养。连续培养12 d以后，耳皮成纤维细胞生长至约90%汇合度时，按常规方法传代培养。弃去原有培养液，用DPBS冲洗细胞后，加入0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）消化2~3 min。细胞脱壁后加入含10%FBS的α-MEM培养液终止消化。离心并收集细胞，按照1︰3比例分瓶传代培养。成纤维细胞传至6~8代时用于染色体标本制备。
1.3梅花鹿体细胞的航天培养方法
根据实验经费和实验材料的特殊性，此次实验按照本实验室自主研发的新型成纤维细胞在太空环境的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）培养方法，将梅花鹿体细胞搭载于实践10号返回式科学实验卫星上，并在太空中飞行12 d后进行回收、培养和保存。具体实验方法参照用于航天生物育种的家畜成纤维细胞培养方法（内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物学技术研究院有限公司2016），实验流程见图1。
1.3.1培养基配制
实验中共使用了2种培养基，具体配制方法如下。
1×液体培养基：5 ml胎牛血清（FBS），0.5 ml青霉素/链霉素双抗，用MEM-Alpha（1×）培养液定容至50 ml。
琼脂固体培养基：首先配制1%琼脂，称取5.0 g琼脂并加入50 ml蒸馏水，微波炉加热融化后，进行高压灭菌。之后配制2×液体培养基：20 ml胎牛血清（FBS），1 ml青霉素/链霉素双抗，1 ml非必须氨基酸（essential amino acid，NEAA），用2×MEM定容至50 ml。最后，将1%琼脂灭菌后冷却至40℃左右，与38℃预热的2×液体培养基按1︰1混合配制成0.5%琼脂固体培养基。
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