贝氏柯克斯体在高渗脱水环境中的生物学特性研究（二）
1.3基因组拷贝数变化与生长曲线的测定
分别于培养周期第0 d与第7 d收取已接种贝氏柯克斯体的高渗压组(ACCM+10×NaCl)、常规组(ACCM-2)及低渗组(ACCM+1/100×NaCl)培养基,后用试剂盒提取NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl基因组DNA,通过Taqman探针法进行实时荧光定量PCR测定培养前后各组dotA基因拷贝数变化情况,做柱状图并以t检验统计分析组间差异。分别收集培养周期中第0 d至第7 d的贝氏柯克斯体菌液,提取基因组DNA后以荧光定量PCR测定dotA基因拷贝数并计算标准差,以折线图描记生长曲线。荧光定量PCR反应条件设定为:95℃预变性10 min,94℃变性15 s后60℃退火1 min共40个循环,PCR扩增曲线R2值均为99%以上,且P<0.05,实验所需引物及探针序列如表2。
表2荧光定量PCR反应所需引物及探针序列
1.4贝氏柯克斯体BGMK细胞的感染与VFU的测定
在培养周期第7 d分别离心收取ACCM+10×NaCl、ACCM-2及ACCM+1/100×NaCl培养所得菌体NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl,用试剂盒提取基因组DNA后以qPCR定量测定菌体拷贝数。将新传代的BGMK细胞经细胞计数板精确计数后接种24孔培养板后置于5%CO2,37℃培养箱静置培养形成细胞单层,以感染复数(MOI,Multiplicity Of Infection)5:1的比例加入菌体后以300 g离心感染30 min,将已感染的细胞在RPMI1640培养基以及37℃,5%CO2培养箱种静置培养7 d。用倒置相差显微镜在200×放大倍数下分别观察计数NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl感染细胞后的囊泡数量,即集落形成单位(VFU,Vacuole Forming Units),分别计算并作柱状图统计分析,进一步在400×倍数放大下观察囊泡内菌体形态。
1.5透射电子显微镜技术对比分析菌体形态
取经qPCR定量后的贝氏柯克斯体菌体NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl,用PBS清洗5遍后将菌液样品先后置于50%至100%梯度浓度的丙酮溶液中脱水1 h,将样品包埋多孔橡胶包埋模板中形成包埋块,乙酸双氧铀染色4 h,后用Hitachi H-7600透射电子显微镜观察并拍照记录。相似的,用细胞刮刀收取贝氏柯克斯体感染后第7 d的BGMK细胞,经磷酸-戊二醛溶液充分固定后,按照文献报道的操作步骤SOP进行脱水、浸透包埋并制作超薄切片后用Hitachi H-7600透射电镜观察记录并对比分析菌体形态。
2结果
2.1贝氏柯克斯体可耐受高渗透压无细胞培养环境并存活
无生命培养系统的建立,不仅为该菌的克隆纯化与遗传学操作提供了全新技术工具,也进一步揭示了该菌繁殖生长的必需条件。研究发现在ACCM-2液体培养基中终浓度125 mmol/L的NaCl有助于该菌基因组实现2倍log10以上的增长,同时Na+及Cl-也是无生命培养体系中渗透压的主要决定因素。我们通过如表1所示10倍增加ACCM-2培养基中的NaCl终浓度至125 mmol/L改变菌体生长环境中的渗透压条件,使菌体在单个培养周期中持续脱水,同时10倍减低NaCl终浓度至1.25 mmol/L使菌体在低渗压下连续培养7 d。倒置相差显微镜下初步观察见菌体形态较常规培养菌体相比,以散在的细小球杆状为主,其形态类似于该菌双相发育周期中的小贝氏体(SCVs)。进一步以菌体NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl感染BGMK细胞后连续观察,镜下放大(400×)后可见NMII10×NaCl感染细胞后12 h可正常形成繁殖囊泡(CCV),菌体正常生长并在7 d后可见充满菌体的CCV囊泡,对比常规组及低渗压组,可见已形成的囊泡形态无明显差别,菌体在囊泡内正常生长,如图1。这说明贝氏柯克斯体可耐受高渗压的无生命培养环境并适应性存活7 d以上,同时提示无生命培养环境中的高渗透压条件可能并未显著影响细菌对真核细胞的感染能力。
图1梯度渗透压培养后的贝氏柯克斯体感染BGMK细胞
注:A为NMII10×NaCl;B为NMII;C为NMII1/100×NaCl,均为感染后第7 d
2.2贝氏柯克斯体在高渗压无生命培养环境下基因组拷贝无明显改变且菌体未生长
据报道,贝氏柯克斯体基因组可在ACCM系列培养基中完成(2~4)log10的增长,而在自然界中该菌可耐受干燥脱水适应性存活并广泛传播。因此,在以ACCM-2为基础的高渗脱水研究模型中,有必要测得菌体基因组拷贝变化。我们通过qPCR测得在单个培养周期内高渗透压组菌体NMII10×NaCl基因组拷贝无显著改变,而在低渗压下NMII1/100×NaCl基因拷贝可有限增长0.7log10,同时对照组NMII基因拷贝可增加2.7log10。进一步以第0至7 d基因拷贝绘制生长曲线,可见对比NMII的指数生长,菌体NMII10×NaCl在接种后48 h适应性存活但未生长,相反,菌体NMII1/100×NaCl在接种后72 h开始即进入平台期,如图2所示。
图2贝氏柯克斯体在渗透压梯度的无生命培养基中的生长特性
注:A为贝氏柯克斯体在渗透压梯度无生命培养下的基因组拷贝数;B为贝氏柯克斯体在渗透压梯度培养条件的生长曲线
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