贝氏柯克斯体在高渗脱水环境中的生物学特性研究（一）
摘要
目的基于无生命培养体系,探索建立贝氏柯克斯体耐受脱水的实验室研究模型。方法梯度调整贝氏柯克斯体无生命培养体系中的渗透压条件,利用qPCR定量测定不同渗透压下贝氏柯克斯体在培养周期内基因组拷贝数变化并描记生长曲线,进一步利用相差显微镜、透射电子显微镜对真核细胞以及无细胞培养方法所得贝氏柯克斯体进行形态学分析,并感染BGMK细胞测定不同渗透压培养所得贝氏柯克斯体的感染性VFU。结果贝氏柯克斯体可在高渗透压条件的无生命培养基中适应性生存7 d以上,经高渗透压培养后的菌体脱水收缩且大小类似于小贝氏体,同时感染后24 h的VFU较对照组降低。结论成功建立了贝氏柯克斯体耐受高渗压脱水的研究模型,为下一步用蛋白质组学等方法研究贝氏柯克斯体在自然环境中耐受干燥脱水的遗传学机制奠定了基础。
贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,C.burnetii)是一种世界范围广泛存在的革兰氏阴性细胞内寄生菌,可通过气溶胶吸入方式传播感染人导致不明热(Query fever,Q热),故又称Q热立克次体。该病原对各种自然环境的抵抗力强,可耐受多种外界失活条件如化学试剂、紫外辐照以及干燥脱水而存活致病,因而又被联合国列为经典的生物战剂与生物恐怖剂。传统上,由于贝氏柯克斯体专性胞内寄生的繁殖特性,一直以来该病原的研究局限于体内实验模型,如豚鼠等哺乳动物的感染、鸡胚接种以及细胞培养等,极大限制了该菌对脱水等无生命环境的耐受性研究。近年来,随着多种无生命培养方法(Acidified Citrate Cysteine Media,ACCM)的研制,为进一步研究贝氏柯克斯体耐受高渗透压干燥脱水的生物学特性提供了全新技术平台。
在自然环境中,目前贝氏柯克斯体被认为大多以耐受干燥脱水环境的毒力菌株小贝氏体(Small Cell Variants,SCVs)存在,相反的,在体内繁殖生长时,贝氏柯克斯体表现为双相发育周期,即在单个繁殖周期(7 d)内,由形态较小(<1μm)且具有感染性的小贝氏体(SCVs)向繁殖状态的大贝氏体LCV(>0.5μm)转变。这提示我们可利用无生命培养法在实验室内模拟体外环境,适应性培养获得贝氏柯克斯体并进一步评估所得菌体是否具备类似于环境野生株的菌体形态以及感染性。与大多数革兰阴性菌的无生命培养基组分含有高浓度的K+不同,各代ACCM培养基均具有高浓度Na+(~125 mmol/L)而非K+(~5 mmol/L)。作为维持无生命培养基渗透压以及贝氏柯克斯体二分裂繁殖外环境的重要组分,Na+与Cl-终浓度的变化可以使菌体暴露在高渗压脱水环境下,从而可实验室内模拟外界环境中的脱水条件。本研究以无生命培养体系为基础,实验室模拟外界脱水环境并对适应性存活的贝氏柯克斯体生物学特性进行了评价,目的是在本实验室内建立贝氏柯克斯体耐受高渗压脱水的研究模型。
1材料与方法
1.1材料和仪器
贝氏柯克斯体九里II相菌株(Nine Mile phase II,NM II)、绿猴肾细胞(BGMK)均由本科室超低温保存;全基因组DNA纯化提取试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂购自美国Qiagen公司;PCR反应所需引物及Taqman探针由上海生工生物公司合成;实验所用化学试剂购自上海生工公司并均为分析纯级别。实时荧光定量分析仪ABI 7300购自ABI(Applied Biosystems)公司;倒置相差显微镜TS100购自日本尼康公司;透射电子显微镜H-7600购自日本Hitachi公司;恒温低氧培养箱购自日本SANYO公司。
1.2可耐受高渗压脱水存活贝氏柯克斯体的培养
依据国外已报道的方法,分别准确配置不含Na+及Cl-的无生命培养基ACCM-2(-NaCl),以及终浓度为0.3 g/mL的氯化钠母溶液。将氯化钠母溶液分别以终浓度1 250 mmol/L、125 mmol/L、1.25 mmol/L加入24孔板内的ACCM-2(-NaCl)无生命培养基中,完成高渗压组(ACCM+10×NaCl,3 500 mOsm/L)、常规组(ACCM-2,345 mOsm/L)及低渗组(ACCM+1/100×NaCl,40 mOsm/L)培养基的制备,如表1所示。分别向上述ACCM培养基中加入106拷贝的贝氏柯克斯体九里II相菌种,每组均平行重复3次实验,后将24孔板置于2.5%O2,5%CO2,37℃的恒温低氧培养箱中静置培养7 d。
表1渗透压梯度无生命培养基配制条件