副溶血弧菌活菌计数方法：MTT比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线（四）
2.4副溶血弧菌菌液检测
分别采用MTT比色法、ATP发光法和高通量生长曲线法对10份不同浓度的副溶血弧菌菌液进行检测，并与平板计数法进行比较(图9)。结果显示，MTT法计数的9个在线性范围内的样品计数值的对数(LgCMTT)与平板计数法结果的对数(LgCP)之间具有极显著的线性关系(R2=0.9620，P=3.42×10-7)，其关系式为LgCMTT/LgCP=1.0123(图9)。9个样品的变异系数为(18.50±12.03)%，超出检测线性范围的1个样品的浓度为4.82×106 CFU/ml，其变异系数为36.61%。ATP发光法计数的9个在线性范围内的样品计数值的对数(LgCATP)与平板计数法的结果的对数(LgCP)之间具有极显著的线性关系(R2=0.9981,P=1.72×10-11)，其关系式为LgCATP/LgCP=0.9981(图9)。9个样品的变异系数为(8.59±5.90)%，超出检测线性范围的1个样品的浓度为6.43×103 CFU/ml，其变异系数为23.65%。高通量生长曲线法计数的9个在线性范围内的样品计数值的对数(LgCG)与平板计数法结果的对数(LgCP)之间具有极显著的线性关系(R2=0.9985,P=3.89×10-11)，其关系式为LgCG/LgCP=0.9985(图9)。9个样品的变异系数为(9.78±7.46)%，超出线性范围的1个样品的浓度为77.00 CFU/ml，其变异系数为68.43%。
图9 3种高通量活菌计数法与平板计数法的结果比较
上述3种方法与平板计数法的比较显示，ATP发光法和高通量生长曲线法的曲线斜率很接近1，说明这2种方法与平板计数法得出的结果高度接近，而MTT法的斜率与1有所偏离，而且在偏低或偏高浓度上有明显系统误差，说明这一方法所得结果存在一定误差。
3讨论
平板计数作为活菌计数的最基本方法，通常能应用于大多数需要进行活菌计数的场合，但在一些研究不同培养条件，例如液体发酵(高戈等,2017)或固体发酵(孙静等,2017)等；理化因素，例如消毒剂或紫外线等处理；药物制剂，例如中草药或抑菌剂等；这些对特定细菌生长或存活的影响效果时，需要大量的活菌计数工作，而平板计数方法由于工作量大，材料消耗大，在用到这些大量研究对象时效率很低，且不确定度高(凌云等,2010)，因此，需要高效可靠的活菌计数方法。工作效率较高的细菌计数法可采用酶标板的高通量OD值测定，但该方法并不能区分样本中的活菌和死菌，而且如果样本中存在大量带颜色的或悬浮物等干扰光吸收的物质时(孙静等,2017)，就难以进行直接的OD值测定。因此，需要其他的活菌计数方法以弥补在特定应用中的不足。
MTT比色法操作相对简单，能满足高通量操作的需求，适用于较高浓度的活菌数检测，但其检测的线性范围只有2个数量级的跨度。当活菌数较低时，MTT的反应产物过低，从而在OD555 nm值太低而超出检测的线性范围，不适用于检测浓度太低或太高的细菌，由于高通量分析实验的场合常?；嵊邢妇看蟠笃隡TT检测范围的情况发生，这种方法实际上在高通量活菌计数的应用中受到了较大局限，与之前报道的MTT比色法在大肠杆菌活菌计数研究的结论相符合(汪志荣等,2011)。对7.8×106~2.5×108 CFU/ml线性范围内的实际样品进行检测时，所得结果与平板计数结果有一定偏离，5×106 CFU/ml以下的检测结果可能会有明显偏差。此外，不同种类和不同生理状态的细菌中琥珀酸脱氢酶含量可能不同，对多种细菌混合检测的适用性可能受影响。
ATP生物发光法操作更加简便，是3种方法中检测速度最快的，准确性比MTT法高，反应速度较快，能对样品进行实时的检测反馈，线性范围能达到4个数量级的跨度。对1×104~3×108 CFU/ml跨度的线性范围内的实际样品进行检测时，所得结果与平板计数结果高度吻合，对104 CFU/ml以下的检测结果偏差明显增加(Chen et al,2006)。在检测较低浓度的活菌时，需要较长的检测时间来收集微弱的发光，对于大量样品的高通量检测来说，顺序检测过程会造成前后样品的时间差太大，ATP的发光会逐渐消散而对准确性造成显著影响(发光会逐渐消散而对准确性造成显著影Selan et al,1992)。因此，该方法也不适于大样本量的高通量检测。此外，如果样品中有其他来源的ATP干扰，也会对分析的准确性产生很大的影响。
高通量生长曲线法准确性略低于ATP发光法，在本研究的手动操作条件下，检测的线性范围达7个数量级以上，对特别低或特别高的活菌数都能进行有效检测。对100~107 CFU/ml跨度的线性范围内的实际样品进行检测时，所得结果与平板计数结果高度吻合，102 CFU/ml以下的实际样品检测时有误差增大的可能，与Brewster(2003)的研究结果相符。高通量生长曲线法操作耗费时间较长，而且需要定时对OD值进行测定，如果完全人工手动操作，这个过程将较为辛苦。该方法不需要借助特别试剂，可以不受试剂缺乏的限制而得以应用。如果有自动生长曲线测定仪，那这样的操作将十分方便，而且能进一步增加其检测的线性范围和结果的准确性。
综合比较3种高通量方法：ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性，MTT比色法准确度稍差；而高通量生长曲线法有最宽的线性范围，也最适合高通量测定。
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