滇黄精水提物促进罗伊氏乳杆菌生长增殖和定植的作用机制（四）
3.4.2.2 KEGG数据库功能注释和富集分析
利用KEGG数据库，将差异基因富集在各自参与的代谢通路中。差异基因的富集可以确定不同基因所涉及的生化代谢途径及信号传导过程。本研究将正常组与滇黄精水提物共孵育组的差异基因在KEGG数据库对比，按照差异基因注释量大小依次排序，选取前20个通路（图4B），有276条差异基因被注释到5个大类中，包括人类疾病、遗传信息处理、环境信息处理、生物体系统、代谢。差异基因主要富集在，翻译过程（Translation）、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）和核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）。差异基因富集最多的通路为代谢类途径。
将正常组与滇黄精水提物组的差异表达基因进行KEGG富集分析，选取最显著的前20条通路。如图5所示，横坐标Rich Factor是衡量差异表达基因中富集程度的指标，纵坐标为通路，图中点越大代表注释到KEGG通路上的基因数越多，颜色越红代表显著性越大。其中5个显著富集的KEGG途径分别为嘧啶代谢（Pyrimidine metabolism）、核糖体（Ribosome）、赖氨酸生物合成（Lysine biosynthesis）、柠檬酸循环TCA Citrate cycle（TCA cycle）、脂肪酸合成（Fatty acid biosynthesis）。
图5 KEGG富集分析气泡图
3.4.3滇黄精水提物促进L.reuteri 1.2838生长、促群体感应信号分子和抗胁迫的关键基因及功能分析
FPKM是用来衡量基因表达水平的常用指标。采用FPKM定量表示不同样本间基因的表达水平差异。
差异基因富集最多的前20条KEGG途径中有三羧酸循环（TCA）。在生物体内，TCA循环不仅能为生物体提供能量，还是糖类、脂类、氨基酸等代谢的中心枢纽。丙酮酸是机体代谢的中间产物，处于糖酵解途径的末端，同时又连接着己糖磷酸途径（EMP）和TCA，处于代谢途径中的关键代谢支点。丙酮酸由丙酮酸脱氢酶催化脱羧，转化为乙酰CoA，调控机体生长代谢。丙酮酸脱氢酶由三种酶（丙酮酸脱氢酶组分、二氢硫辛酰转乙?；?、二氢硫辛酸脱氢酶）和六种辅助因子组成。经滇黄精水提物处理后，给药组丙酮酸脱氢酶（PDHA、PDHB）、二氢硫辛?；阴；福―LAT）和二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）基因的表达均上调（图6）。PDHA和PDHB位于线粒体丙酮酸到乙酰辅酶A生物合成过程的上游或内部，催化S-乙?；饬蛐刘０?E（S-acetyldihydro-lipoamide-E）生成。DLD将丙酮酸脱氢酶复合物中硫辛酰胺转乙酰基酶（或二氢硫辛酰琥珀酰转移酶）的辅基二氢硫辛酰胺脱氢从而转化为氧化型硫辛酰胺。dlat基因的蛋白质产物二氢硫辛酰胺乙酰转移酶接受丙酮酸氧化脱羧形成的乙?；⒔渥浦粮窤，进而影响循环。通路中pdhA、pshB、dlat、dld分别上调了4.96、5.94、6.69、4.18倍，能更好促进丙酮酸脱羧形成乙酰CoA，乙酰CoA进入循环，氧化释放能量，从而促进L.reuteri 1.2838的生长增殖。
图6 TCA循环差异表达基因
AI-2的合成途径主要有2类：AI-2的经典合成途径和半生物合成途径。经典途径信号分子AI-2的合成是由S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）经过高半胱氨酸核苷酶（Pfs）和S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（LuxS）的一系列反应被分解转化成腺嘌呤、同型半胱氨酸和4，5-二羟基-2，3-戊二酮（4，5-Dihydroxy-2，3-pentanedione），简称DPD。DPD不稳定，能自发环化形成不同的呋喃化合物，从而形成AI-2信号分子或AI-2的前体物质。LuxS肩负着代谢和信号传递的双重功能，是AI-2合成路径中的关键基因，如图7所示，与滇黄精水提物共孵育组luxS基因表达量显著高于正常组。
图7群体感应通路差异表达基因
NprR-NprX系统是一种群体感应机制，能通过调节基因的表达来控制细菌的存活。Sec基因能影响NprX信号肽前体，促使NprX信号肽与NprR结合，激活NprR、脂肽表达，间接作用于细菌生物膜表达。给药组luxS、secE、secA、secG基因表达量分别上调了1.26、5.18、4.82、2.57倍，提示滇黄精水提物对L.reuteri 1.2838群体感应信号分子AI-2产量的增加可能与luxS和Sec基因的上调有关。
胃液和小肠中的胆盐环境会影响益生菌的增殖定植。因此提高益生菌抵抗消化道环境胁迫的能力和在消化道内存活率是其发挥生物活性的基础。陈秋定等研究发现滇黄精水提物与益生菌L.reuteri 1.2838共孵育后，菌株群体感应分子AI-2的生成量、抗胃肠道胁迫能力和抗饥饿胁迫能力都得到提高。提示滇黄精水提物对L.reuteri 1.2838抗酸、抗胆盐以及黏附等益生菌功能方面有促进作用。
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