厌氧微生物生孢梭菌生长所需的最低水分活度（Aw）【试验】
水分活度（Aw）是评价食品和化妆品微生物风险和产品稳定性的重要依据，在药品微生物控制中，Aw测定已有一定应用前景。Aw与微生物的生长密切相关，微生物又是反映药品安全性和有效性的重要指标，大多数细菌在Aw低于0.91时停止生长，大多数霉菌在Aw低于0.80时停止生长。通过测定Aw，可更好地反映药品质量，且该测定无破坏性，省时省力，设备简单价廉，对于制药产品研发、生产环境控制、包装材料选择与药品成品保存等都有重要意义。一些与制药相关的代表性微生物生长所需的最低Aw，如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和沙门氏菌在水分活度低于0.91的产品中不会增殖或存活，革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌在Aw低于0.86时不会增殖，黑曲霉在Aw低于0.77时不会增殖。但与制药相关的厌氧菌株由于生长条件严苛，其生长所需最低Aw研究较少。
生孢梭菌为厌氧微生物的代表，为梭状芽孢杆菌属，噬菌体约为1μm×5μm的革兰阳性杆菌，该菌未收录于《美国药典》1112的微生物生长所需的最低Aw，查阅国内外文献未找到其生长的最低Aw，因此目前无参考的最低Aw。本研究中参考《美国药典》1112收录肉毒梭菌生长所需最低Aw（0.95），将培养基的Aw调至0.90～0.99，进行预试验及正式试验。现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
菌种：生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕，购自中国医学细菌保藏管理中心，工作用菌株为第3代。
试剂：硫乙醇酸盐流体培养基（-批号为180830），梭菌增菌培养基（批号为170701），哥伦比亚琼脂培养基（批号为170717），均购自北京陆桥技术股份有限公司。丙三醇（批号为20180730），氯化钠（批号为20180509）均购自国药集团化学试剂有限公司；蔗糖（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20170510）。
仪器：Aqualab4TE型水分活度仪（美国Decagon公司）；HFSAFE1200LC型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；SX-500型蒸汽灭菌器（YOMY）；LRH-250F型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；PL202-S型电子天平（瑞士梅特勒公司，d=0.01 g）；厌氧产气包（Mitsubishhi Gas Chemical CO.，INC.批号为8089ZJ-1）。
1.2方法
梭菌增菌培养基配制：分别用氯化钠、蔗糖、丙三醇调节梭菌增菌培养基，灭菌后测量Aw，使其Aw值为0.90～0.98，同时配制不调Aw的梭菌增菌培养基，作为T0。
菌液制备：开启生孢梭菌菌种，将3代微球菌转接至12 mL硫乙醇酸盐流体培养基，30～35℃培养24 h，用无菌生理盐水稀释成每1mL含104cfu菌落数的菌悬液。
接种：取制备好的新鲜菌悬液0.3 mL，加入上述梭菌增菌培养基30 mL中，混匀，其中T0为对照组，其余均为试验组。
培养：将各组试验管置厌氧培养袋中，35℃培养，分别于0，4，6，18，24，48，72，96，120 h时间点，取1 mL稀释至适宜的稀释级接种平皿（直径90 mm），注入温度不超过45℃哥伦比亚琼脂培养基约20 mL，待培养基凝固后装入厌氧培养袋，于35℃厌氧培养72 h，计数。
绘制生长速率曲线：不同介质在获得生孢梭菌生长所需最低Aw后，选择最低Aw T附近的3个水平，即低于Aw限值0.01单位TL，高于Aw限值0.01单位TH分别进行重复3次试验，以测得的菌落数（cfu）的对数值，对时间（h）作图，绘制生长速率曲线。
2结果
2.1氯化钠培养介质下生孢梭菌所需最低Aw
以氯化钠调节梭菌增菌培养基Aw，测定在4种不同Aw（0.94，0.95，0.96，0.97）下生孢梭菌的生长速率。3次重复试验结果均显示，Aw值为0.94时，生孢梭菌不生长；比较3次试验结果，第3次试验结果显示，Aw值为0.95时，生孢梭菌出现缓慢生长迹象（图1）；Aw≥0.96时，生孢梭菌可正常生长?？杉月然频鹘谒缶鼍旱腁w，生孢梭菌生长所需的最低Aw范围为0.95～0.96。另外，由生长速率曲线可见，生孢梭菌一般在培养24 h后进入对数生长期，在培养48 h后可达到生长稳定期。
2.2蔗糖培养介质下生孢梭菌所需最低Aw
以蔗糖调节梭菌增菌培养基Aw，测定在4种不同Aw（0.94，0.95，0.96，0.99）下生孢梭菌的生长速率。3次重复试验结果均显示，Aw为0.94时，生孢梭菌不生长（图2）；Aw为0.95时，生孢梭菌出现缓慢生长迹象；Aw≥0.96时，生孢梭菌可正常生长?？杉?，以蔗糖调节梭菌增菌液的Aw，生孢梭菌生长所需的最低Aw范围为0.95～0.96。
2.3甘油培养介质下生孢梭菌所需最低Aw
以甘油调节梭菌增菌培养基Aw，测定在3种不同Aw（0.91，0.92，0.93）下生孢梭菌的生长速率。3次重复试验结果均显示，Aw为0.91时，生孢梭菌不生长（图3）；Aw≥0.92时，生孢梭菌可正常生长?？杉?，以甘油调节梭菌增菌液的水分活度，生孢梭菌生长所需的最低Aw为0.92。
3讨论
生孢梭菌是严格厌氧菌，菌龄、培养基、培养条件对试验结果的影响非常大，每次试验都必须制备新鲜菌种，保证菌龄及菌的活性；梭菌增菌液培养基主要是琼脂和半胱氨酸，起到保证培养基体系厌氧环境的作用，随着时间的增长，体系的还原物质会被消耗，这使得0 h刚加入的菌的存活率受到威胁，故每次试验都必须采用新鲜配制的培养基；培养条件采用厌氧培养袋，每个时间节点进行计数的同时，对厌氧环境有更高要求，也会对试验结果的稳定性产生影响，针对该项问题，快速试验，尽可能每个时间点重新放置厌氧产气袋，保证厌氧培养条件；不同的介质，生孢梭菌生长所需最低Aw不同，其中甘油的试验结果相对稳定，生孢梭菌生长所需最低Aw最低，尤其在0 h时，同样的接菌量，甘油测得的菌落数常高于蔗糖和氯化钠，有时甚至高于对照组，甘油本身有助于厌氧条件的保存。
图3甘油培养介质下生孢梭菌生长所需最低水分活度
2015年版《中国药典（四部）》中，生孢梭菌在阴道、尿道及固体局部给予非无菌制剂中被列为控制菌，故本研究对于制药产品研发、生产环境控制、包装材料选择及药品成品贮存及日常微生物限度检查均有价值。与在制药工业中广泛采用的水含量的物理意义相比，Aw更有助于理解制药产品的相关领域的科学内涵?！睹拦┑洹贰杜分抟┑洹芬岩馐兜搅薃w及其应用的重要性，先后推出了Aw规定。故建议建立合理微生物相关Aw控制策略，从而进一步推动我国微生物控制的发展。
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