滇黄精水提物促进罗伊氏乳杆菌生长增殖和定植的作用机制（一）
摘要
目的
研究滇黄精水提物（Polygonatum kingianum water extract，PW）对罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）1.2838增殖、群体感应信号分子AI-2生成及抗胁迫相关基因的差异表达，揭示滇黄精水提物促进L.reuteri 1.2838增殖和定植的作用机制。
方法
将L.reuteri 1.2838在含有0.0126 g·mL-1 PW的MRS培养基中37℃厌氧培养，绘制生长曲线。通过Vibrio harveyi BB170生物发光法测定AI-2生成的量。采用Illumina HiSeq进行转录组测序后，筛选差异表达基因。分析差异基因表达情况，并采用实时荧光定量PCR验证。
结果
经PW孵育后L.reuteri 1.2838的增殖和AI-2生成能力提升。转录组测序得到425个显著差异表达基因，其中上调253个，下调172个。经GO和KEGG注释分析后，与L.reuteri 1.2838增殖相关基因pdhA、pshB、dlat、dld，与产AI-2相关基因luxS、sec，以及与菌株抗胁迫相关基因groEL、groES、gltC的表达量均显示出上调趋势。
结论
PW通过影响L.reuteri 1.2838的三羧酸循环、群体感应系统以及抗逆境能力，促进该菌株的增殖和定植，从而为滇黄精和罗伊氏乳杆菌的研发提供理论支持。
“食药同源”品种中药材滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.Et Hemsl），具有养阴润肺、补脾益气、滋肾填精的功效。现代药理研究表明滇黄精在防治代谢性疾病方面有一定效果?；凭傻鹘诟咧炒笫蟮某Φ谰航峁?，增加挥发性脂肪酸产生菌的相对丰度，促进挥发性脂肪酸的产生来维持肠道的正常功能并降低肠道的通透性，避免脂多糖进入循环系统引发炎症反应，进而防治脂代谢紊乱[1]。
益生菌是指当摄入量足够时，能对宿主健康产生有益作用的活性微生物[2]。益生菌在肠道菌群中发挥重要作用。当肠道菌群紊乱时益生菌能增强肠道黏膜屏障功能，抑制肠道内有害细菌的生长，阻止病原菌的黏附和定植，从而维持肠道的微生态平衡[3]。罗伊氏乳杆菌是已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的益生菌，能调节宿主肠道菌群的平衡、降低胆固醇水平、增强免疫力、发挥抗氧化作用[4]。细菌中存在互相交流的现象，这种行为被称为群体感应（Quorum sensing，QS）现象。细菌向外分泌QS信号分子（Quorum sensing molecules，QSM），信号分子随着细菌密度的增长而增加，当信号分子到达阈值时，信号分子则能与受体结合并通过一系列的反应调控生理活动[5]。Autoinducer-2（AI-2）信号分子是革兰氏阴性细菌和阳性细菌均可分泌的自诱导物[6]。细菌利用AI-2群体感应信号分子与周围环境中的其他细菌进行信息交流，并且从AI-2分子反馈的信号来调控菌体相应基因的表达，使得菌体更加适应周围环境[7]。益生菌的群体感应现象在调节益生菌的益生特性和环境适应方面扮演着重要的角色，AI-2信号分子的生成能提高乳酸菌的抗胁迫能力，促进细菌生物膜的形成，提高细菌的黏附能力[4]。
课题组前期研究发现滇黄精水提物在一定程度上能提高L.reuteri 1.2838在胃肠道胁迫条件下AI-2的生成量[4]，研究表明AI-2的产生能够促进益生菌的增殖和定植，进而有助于益生菌成为肠道中的优势菌群并调节肠道菌群失衡，从而改善宿主的糖脂代谢紊乱[8]。然而，目前关于PW提升L.reuteri 1.2838增殖和定植能力的具体作用机制尚未得到明确阐释，因此进一步分析PW对L.reuteri 1.2838增殖、定植作用的影响，挖掘通路中涉及的相关基因并阐释其作用机制，对研究与开发PW及L.reuteri 1.2838具有重要意义。本实验拟通过转录组测序分析滇黄精水提物对L.reuteri 1.2838生长和群体感应信号分子AI-2生成量的影响，揭示了菌株生长和产AI-2的关键基因，为滇黄精和罗伊氏乳杆菌的开发提供理论依据。
1材料
1.1菌种
益生菌Lactobacillus reuteri 1.2838购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。报告菌株哈维氏弧菌Vibrio harveyi BB170（菌种编号BNCC337376）购买于北京北纳生物有限公司。
1.2试剂
滇黄精购买于云南省文山壮族苗族自治州文山市圣农道地药材有限公司，该药材经赵荣华教授鉴定为百合科植物滇黄精Polyonatum kingianum Coll.et Hemsl的根茎。2.5 L圆底立式厌氧培养袋、2.5 L厌氧产气袋购自青岛海博生物技术有限公司。MRS培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。2216E培养基购自青岛海博微生物技术有限公司。MJZol总RNA提取试剂盒，RNA纯化试剂盒购自上海美吉生物医药科技有限公司。
1.3仪器
垂直流洁净工作台（HCB-1300V）（青岛海尔生物医疗股份有限公司）。恒温摇床（ZHWY111B）（北京瑞尔欣德科技有限公司）。冷冻离心机（H1750R）（湖南湘仪有限公司）。冷冻干燥机（FD5-3）（美国SIM公司）。全波长扫描多功能酶标仪（VARIOSKAN FLASH）（美国Thermo公司）。NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）。Agilent 5300生物分析仪（美国Agilent公司）。Qubit 4.0荧光定量仪（美国Thermo公司）。T100 Thermal CyclerPCR仪（美国BIO-RAD公司）。NovaSeq 6000测序仪（美国illumina公司）。
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