基于微生物生长曲线监测系统探究肺炎克雷伯菌菌株毒力与碳青霉烯类耐药性的关系（三）
2.4 CR-HVKP菌株的基因组特征和药敏试验结果
CR-HVKP菌株分离自重症监护病房的一例41岁急性白血病女性患者，同时患有肺炎和肝包虫病，并发感染性休克。PCR未检测到该株CR-HVKP菌株携带碳青霉烯类基因，全基因组测序结果显示其携带blaSHV-145、blaTEM-1、blaCTX-M-3、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac（3）-IId耐药基因，MLST型别为412，OmpK35和OmpK36基因中存在IS10L插入序列，携带rmpA、iutA、entB、mrkD和fimH毒力基因，荚膜抗原分型为K57，具有高黏表型。药敏试验结果显示，该株CR-HVKP对头孢类、酶抑制剂、厄他培南和美罗培南耐药，对亚胺培南中介，对氟喹诺酮类敏感。由于患者存在免疫缺陷及多重感染，故采用头孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星、亚胺培南单用或联用进行抗感染治疗，同时接受长春瑞滨和顺铂化疗。患者最终因本次感染预后不佳要求出院。
2.5 CR-HVKP菌株的毒力鉴定结果
生物膜形成试验发现，不携带碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、携带碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、标准菌株ATCC700603的吸光度值依次为0.480、0.297、0.628、0.500、0.767、0.292，其中CR-HVKP生物膜形成能力最强，其后依次为携带碳青霉烯酶基因CRKP（强）、CS-HVKP（中等）、不携带碳青霉烯酶基因CRKP（中等）、CSKP（弱）和标准菌株ATCC700603（弱）。血清抗性试验结果显示，CR-HVKP和CS-HVKP为高抵抗（6级），携带碳青霉烯酶基因CRKP为中等抵抗（4级），其余菌株对血清无抵抗（2级），见图1。结果表明，CR-HVKP菌株的毒力较CRKP、CSKP和CS-HVKP菌株均有明显提高。
图1六株肺炎克雷伯菌血清抗性试验结果
CR-HVKP携带5个毒力基因（entB、rmpA、mrkD、iutA和fimH），呈现高黏表型，未检测到碳青霉烯酶基因；不携带碳青霉烯酶基因CRKP携带3个毒力基因（entB、mrkD和fimH）；携带碳青霉烯酶基因CRKP携带blaKPC-2基因和3个毒力基因（entB、mrkD和fimH）；CS-HVKP携带7个毒力基因（entB、mrkD、fimH、iutA、rmpA、ybtS和aerobictin），呈现高黏表型；CSKP携带3个毒力基因（entB、mrkD和fimH）.CR-HVKP：碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌；CS-HVKP：碳青霉烯类敏感高毒力肺炎克雷伯菌；CSKP：碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌；entB：铁载体肠杆菌素；rmpA：黏液样表型A调节基因；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；iutA：铁载体气杆菌素；fimH：黏附因子1型菌毛基因；ybtS：铁载体耶尔森杆菌素；aerobictin：铁载体需氧菌素.
3讨论
肺炎克雷伯菌引起的血液感染病死率高、患者住院时间延长和医疗费用增加。全球肺炎克雷伯菌的耐药性和毒力水平升高，需要寻找新的治疗方案。本研究对四川大学华西医院192例血液感染的肺炎克雷伯菌进行分析，探讨肺炎克雷伯菌毒力因子与碳青霉烯类耐药性之间的关系。
本文资料显示，96株CRKP中携带blaKPC-2占83.7%，携带blaNDM-5占12.0%，同时携带blaKPC和blaNDM占4.3%，与Wang等的研究结果基本一致。
肺炎克雷伯菌的耐药性已成为公认的治疗难题，而高毒力菌株的存在则会使得治疗更加困难。截至目前，与肺炎克雷伯菌毒力相关的因素主要有荚膜、铁载体、脂多糖、毒力质粒pLVPK和KPHP1208致病岛等。本研究对肺炎克雷伯菌毒力相关的菌毛（mrkD、fimH）、铁载体（entB、aerobictin、iutA、ybtS、Kfu）、尿囊素代谢（allS）和荚膜（K1、K2、K5、K20、K54、K57、rmpA、magA）进行研究。其中，菌毛与细菌黏附有关；铁载体相关蛋白如Kfu蛋白可通过螯合作用促进游离铁吸收，并促进Kfu基因编码产物的产生，提高细菌的生长和定植能力；在需氧或厌氧条件下，allS基因负责尿囊素的厌氧同化，作为碳、氮和能量的唯一来源，小鼠致死试验显示allS基因与菌株的毒力显著相关；荚膜可以?；は妇槐煌淌?，通过阻止抗菌肽和补体在细菌表面的沉积，避免抗菌肽和补体的杀菌作用。本文资料显示，CRKP和CSKP携带mrkD和fimH的比例均超过90%，表明肺炎克雷伯菌普遍产生Ⅰ型和Ⅲ型菌毛。但是，与CRKP比较，CSKP中aerobictin、iutA、ybtS和Kfu的阳性率明显升高，提示CSKP比CRKP具有更强的存活、定植和铁摄取能力；CSKP中allS基因和荚膜相关基因的阳性率也均高于CRKP，且与高毒力相关的荚膜血清型K1和K2在CSKP中更为常见，检出率分别为20.8%和13.5%。
此外，既往研究显示，与侵袭性感染密切相关的allS和Kfu仅存在于荚膜血清型K1的肺炎克雷伯菌中；而本研究在K57 CRKP和K1 CSKP分离株中均检出allS和Kfu基因，推测荚膜血清型K57菌株亦可能与侵袭性感染高度相关。此外，17.7%CSKP携带10种毒力基因，13.5%CSKP携带7种毒力基因，但大多数CRKP（87.5%）只携带3种毒力基因。上述结果提示，CRKP虽能抵抗抗菌药物，但其捕获铁离子和逃避宿主免疫攻击的能力不如CSKP；CRKP携带的毒力基因数和种类少于CSKP，荚膜抗原（K1和K2）主要存在于CSKP细菌中，其原因可能是基于能量平衡规律，在获得耐药基因的同时，毒力基因相对减少。
目前关于HVKP的定义仍存在争议。第一株HVKP分离自化脓性肝脓肿患者，该菌株同时具有高黏表型。此后，高黏表型被广泛用作HVKP的标志，即拉丝实验结果在5 mm及以上。但是，Russo等评估了拉丝实验、毒力因子、荚膜分型等在HVKP检测中的作用，发现拉丝实验阳性菌株不一定具有黏液样表型，具有高黏液特征的菌株拉丝实验可呈阴性；尽管拉丝实验检测HVKP存在诸多问题，但其准确率可达90%；同时发现评价毒力准确率最高的毒力基因为iroB、iutA、rmpA和rmpA2，阳性率均超过95%。Yang等也发现HVKP的拉丝实验未呈阳性，通过嗜中性粒细胞杀伤实验和大蜡螟感染模型证实携带rmpA/rmpA2、沙门菌素相关基因iroBCDN和需氧菌素铁摄入系统（iucABCD）的肺炎克雷伯菌具有较强的毒力。从临床表现来看，HVKP多引起患者转移性感染，如血流感染、化脓性肝脓肿、肺炎、胆道感染、软组织疾病和自发性细菌性腹膜炎。纳入本次研究的肺炎克雷伯菌均分离自血流感染患者，结合菌株的毒力特性（携带rmpA和iutA基因并具有高黏表型），本研究将符合这类特征的肺炎克雷伯菌定义为HVKP。本文资料中，共检出1株CR-HVKP和36株CS-HVKP。
本文资料中这株CR-HVKP菌株分离自重症监护病房的一例41岁女性血液肿瘤患者，虽然菌株对抗菌药物的敏感性较好，但住院期间使用头孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星和亚胺培南治疗后预后仍不理想。经检测，该株CR-HVKP不携带碳青霉烯酶基因，具有高黏表型，荚膜分型为K57，携带多种毒力基因（rmpA、iutA、entB、mrkD、fim），表现出较强的血清抵抗性和生物膜形成能力。进一步分析发现，CR-HVKP菌株携带blaSHV-145、blaTEM-1和blaCTX-M-3基因，OmpK35和OmpK36存在变异，MLST型别为412，推测该菌株对碳青霉烯类耐药的机制是OmpK35/OmpK36异常伴随ESBL的产生。Zhang等报道了一株MLST型别为65的CR-HVKP菌株，其携带blaCTX-3、blaDHA-1、blaSHV-11和blaTEM-53基因，伴随OmpK35/OmpK36表达减少，同时表达ESBL基因，为K2荚膜型，且携带rmpA、aerobactin和entB毒力基因，对除替加环素外的抗菌药物耐药；Li等也报道了MLST型别为11型的CR-HVKP伴随OmpK35/OmpK36缺失。结合本文资料，推测OmpK35/OmpK36变异可能与HVKP的毒力相关，但有待进一步研究证实。
综上所述，CRKP对抗菌药物的耐药率明显高于CSKP，虽然其携带的毒力基因数和种类均少于CSKP，但也出现了碳青霉烯类耐药且高毒力的新型MLST型肺炎克雷伯菌。提示临床和实验室应关注这类病原菌，并结合患者临床症状和实验室提供的检测结果尽早明确诊断，对患者提前进行干预治疗，以期改善患者预后。
数据说明本研究提供的全基因组测序数据可在NCBI Sequence Read Archive（SRA）中获得，检索号为PRJNA786277
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