基于微生物生长曲线监测系统探究肺炎克雷伯菌菌株毒力与碳青霉烯类耐药性的关系（一）
摘要
目的
探讨本地区从血培养分离的肺炎克雷伯菌临床株的毒力与碳青霉烯类耐药表型的关系，并对碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-HVKP）进行毒力表型验证。
方法
收集2016—2019年血流感染患者血培养分离的192株非重复肺炎克雷伯菌，其中96株为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP），96株为碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）。采用全自动微生物生长曲线监测仪检测菌株对药物的敏感性，聚合酶链反应检测碳青霉烯类耐药基因、毒力基因和荚膜分型，拉丝实验检测菌株的高黏表型，全基因组测序方法检测CR-HVKP菌株的基因组特征，并通过血清抗性试验和生物膜形成试验进一步验证CR-HVKP的毒力。
结果
CRKP对常见抗菌药物耐药率高，CSKP则对常见抗菌药物较敏感；除米诺环素外，CRKP组和CSKP组菌株对抗菌药物的耐药率差异均有统计学意义（均P<0.05）。96株CRKP中，92株携带碳青霉烯酶基因，以blaKPC-2为主。在毒力因子方面，4株CRKP和36株CSKP拉丝试验阳性，呈现为高黏表型，两者差异具有统计学意义（P<0.05）。与CRKP组比较，CSKP组Kfu、aerobictin、iutA、ybtS、rmpA、magA、allS等毒力基因检出率均增加，荚膜抗原K1和K2检出率也增加（均P<0.05）。CRKP组检出高毒力肺炎克雷伯菌（HVKP）1株（即CR-HVKP），CSKP组检出HVKP 36株，差异有统计学意义（P<0.05）。全基因组测序结果显示，CR-HVKP多位点序列分型为412，荚膜抗原为K57，携带iutA、entB、mrkD、fimH和rmpA毒力基因，生物膜形成能力和血清抵抗力强，同时携带blaSHV-145、blaTEM-1、blaCTX-M-3、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac（3）-IId耐药基因，伴随外膜蛋白K（OmpK）35和OmpK36的异常。
结论
CRKP对抗菌药物的耐药率明显高于CSKP，虽然其携带的毒力基因数和种类均少于CSKP，但也出现了碳青霉烯类耐药且高毒力的新型多位点序列分型肺炎克雷伯菌。后者可能对公共卫生造成严重威胁。
高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）；碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）；碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae，CR-HVKP）；碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive Klebsiella pneumoniae，CSKP）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；碳青霉烯类敏感高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive and hypervirulent Klebsiella pneumonia，CS-HVKP）；黏液相关基因A（mucoviscosity-associated gene A，magA）；尿囊素代谢基因（allantoin metabolism，allS）；黏液样表型A调节基因（regulator of mucoid phenotype A，rmpA）；黏附因子3型菌毛基因（type 3 fimbria adhesin subunit MrkD，mrkD）；黏附因子1型菌毛基因（fimbrial adhesin，fimH）；克雷伯菌铁摄取蛋白（Klebsiella ferric iron uptake，Kfu）；铁载体肠杆菌素（enterobactin，entB）；铁载体耶尔森杆菌素（yersiniabactin，ybtS）；铁载体气杆菌素（ferri-aerobactin uptake，iutA）；多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）；外膜蛋白K（outer membrane protein K，OMPK）；产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBL）
血流感染可发展为严重脓毒血症、感染性休克和多器官衰竭综合征，患者病死率为28%~41%，其中由肺炎克雷伯菌引起的血流感染患者病死率可达50%左右。上世纪八十年代，中国台湾地区发现了第一例造成致死性化脓性肝脓肿的HVKP，随后全世界范围内相继报道，主要的荚膜分型为K1和K2。HVKP一般具有高黏表型、毒力和传播力强等特征，主要可引起肝脓肿和脓毒血症等，其主要毒力因子为荚膜、菌毛、铁载体和脂多糖。研究显示，大多数HVKP对常用抗菌药物敏感。但近年来肺炎克雷伯菌的耐药水平日益提高，CRKP的检出率不断升高。CHINET（www.chinets.com）数据显示，2023年CRKP检出率约为30%。CRKP对大多数抗菌药物耐药，临床治疗棘手。一项纳入129例CRKP血流感染患者的研究显示，患者28 d病死率为80.6%。以往，耐药和毒力是两种不重叠的表型，然而最近有研究报道了CR-HVKP感染病例，兼具高毒力和耐药特性，且CR-HVKP可从不同临床环境中分离出来，这给临床治疗带来了巨大挑战。
本研究基于四川大学华西医院2016—2019年收治的血流感染患者中收集的肺炎克雷伯菌，从分子水平探讨菌株毒力与碳青霉烯类耐药性的关系，并对CR-HVKP的毒力表型进行验证，为医院感染防控提供参考。