基于细菌生长曲线测定探究具核梭杆菌促进肺癌发展的潜在机制（一）
摘要
目的探究具核梭杆菌是否会促进肺癌的发展及其潜在机制。
方法通过细胞实验证实具核梭杆菌能促进肺癌细胞的增殖和转移；通过动物实验验证具核梭杆菌能促进肺癌的发展。对肺癌小鼠的肺泡灌洗液进行16S rRNA基因测序，以及对肺组织进行转录组测序，分析具核梭杆菌对肺癌小鼠肺部菌群的影响及肺组织相关通路的激活情况。
结果具核梭杆菌促进了肺癌上皮细胞A549的增殖和转移。在体内动物实验中，具核梭杆菌感染肺部后肺部结节数量增加，肺组织荧光强度增强。16S rRNA基因测序结果显示，感染小鼠肺部鼠杆状菌属(Muribaculum)、简单螺旋形菌属(Simplicispira)等富集。肺组织转录组结果显示，肺癌小鼠感染具核梭杆菌后激活了IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、金黄色葡萄球菌感染通路、TNF信号通路等与炎症或免疫相关的信号通路。
结论具核梭杆菌感染导致肺部微生物群紊乱，肺组织中多个与炎症和免疫相关的信号通路被激活，从而促进了小鼠肺癌的转移。
肺癌严重威胁着人类的身体健康。每年有100万至800万人被诊断出患有肺癌，其中约100万至600万人死于肺癌[1]。虽然导致肺癌的原因很多，但吸烟仍是主要的风险因素。其他非吸烟因素包括环境和职业暴露、慢性肺部疾病、肺部感染以及不良生活方式等[2]。相关研究发现，在非吸烟人群中肺癌与以慢性气道炎症为特征的疾病密切相关，如慢性阻塞性肺疾病、肺炎衣原体感染、结核分枝杆菌引起的肺结核和呼吸道病毒感染等[3]。这些结果表明，肺部微生物可能在肺癌的发生和发展中发挥重要作用。具核梭杆菌是口腔中常见的革兰氏阴性厌氧菌。它与牙龈卟啉单胞菌及其他微生物共同破坏宿主与微生物之间的平衡，诱发牙周炎[4-5]。随着测序技术的发展，研究人员发现具核梭杆菌也能在结直肠癌组织中富集。进一步研究表明，具核梭杆菌能够促进结直肠癌的发展[6-7]。在ApcMin/+小鼠模型中，通过灌胃方式将具核梭杆菌引入小鼠体内，结果显示其会促进结直肠癌的发生[8]。此外，研究人员利用培养组学技术从肺癌患者的肺泡灌洗液中分离出具核梭杆菌，并通过分析口腔微生物、牙周病与肺癌之间的关联，发现具核梭杆菌可能是肺癌标志物的潜在微生物之一[9-11]。
本研究探讨了具核梭杆菌促进肺癌发展的潜在机制。
1材料与方法
1.1实验菌株与细胞
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)ATCC 25586购自广东省微生物菌种保藏中心。具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)strain-9从北京大学肿瘤医院肺癌患者的肺泡灌洗液中分离并在本实验室保存[9]。以上菌株分别命名为Fn-ATCC和Fn-9。
肺癌上皮细胞A549、人单核细胞白血病THP-1细胞、带有绿色荧光蛋白的小鼠Lewis肺癌细胞(LLC-GFP)均为本实验室保存。
1.2实验动物
选择8周龄、雌性野生型无特定病原体(specific-pathogen-free,SPF)级C57BL/6N小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，饲养于军事医学研究院实验动物中心。
1.3主要试剂和仪器
MTT试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell孔板购自康宁公司；ELISA试剂盒购自达科为生物技术股份有限公司；RNA提取试剂盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、逆转录试剂盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒和SYBR Green qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
IVIS Spectrum小动物活体光学成像系统、PerkinElmer Operetta CLSTM高内涵成像分析系统均购自PerkinElmer公司。
1.4细菌生长曲线的测定
将Fn-9和Fn-ATCC菌液的OD600值调至1.0时，菌液浓度分别为5×107 CFU/mL和1×108 CFU/mL。在24孔板中加入2 mL BHI(脑心浸液肉汤)培养基，并加入50μL上述调好的菌液。培养12 h后取出菌液检测OD600值，之后每隔2 h取出孔板中的菌液测量OD600值，直至36 h结束。将数据导入GraphPad Prism软件中绘制曲线图。