O 型口蹄疫病毒 3D 突变体重组 FMDV 的鉴定及生长曲线的测定（一）
摘要： 本研究利用反向遗传技术构建 O 型口蹄疫病毒（FMDV）3D 蛋白突变毒株 rFMDV-M403A，并分析了其生物学特征。 结果表明，重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变；病毒滴度显示，突变毒株生长速度较野生毒株有所降低，重组病毒毒力显著低于野生毒株；乳鼠感染试验结果显示，突变毒株会使乳鼠存活率提高，肝中病毒载量和组织病变显著降低。 该研究对口蹄疫病毒致病机理的认识及制定防控措施具有重要意义，同时，也为后续开发口蹄疫基因工程疫苗奠定了坚实的理论基础。
口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是一种严重危害偶蹄动物健康的急性、热性、高度接触性传染病，对偶蹄动物的健康构成严重威胁，其病原是口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）。FMDV 的结构由一条单链正链 RNA 和其周围的衣壳蛋白组成，病毒外壳呈现对称的二十面体。 该病毒存在 7 个血清型，分别为 A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3 和 Asia1 型，各型之间无交叉保护反应。 O 型 FMDV 是最为常见和广泛流行的血清型之一。
FMDV 基因组编码 4 种结构蛋白和 9 种非结构蛋白，其中口蹄疫 3D 蛋白是口蹄疫病毒编码的一种非结构蛋白，在口蹄疫病毒的复制过程中起关键作用。 它具有 RNA 聚合酶的活性，能够催化病毒 RNA 的合成，对于病毒基因组的复制以及新病毒粒子的产生是必不可少的。 3D 蛋白在病毒的结构蛋白组装过程中起着关键的辅助作用，确保能够形成完整的病毒粒子，一旦 3D 蛋白的功能受到抑制或被破坏，会导致病毒粒子的组装过程发生异常，进而削弱病毒的感染能力。 因此，对于口蹄疫的诊断与防控而言，3D 蛋白不可忽视。 可以说，3D 蛋白在口蹄疫病毒的复制周期和致病过程中发挥着至关重要的作用。 构建 O 型口蹄疫病毒 3D 突变毒株并分析其生物学特征，对深入理解口蹄疫病毒的致病机制和制定防控策略具有重要意义。
现如今，利用反向遗传操作技术构建全长 cDNA 克隆并拯救病毒已经成为深入研究 FMDV 的一种重要手段。 本研究利用反向遗传技术，对病毒蛋白进行突变改造，研究重组后的口蹄疫病毒 rFMDV-M403A 对乳鼠特异性免疫的影响，为进一步研制口蹄疫基因工程疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 毒株、菌种和细胞株
O 型 rFMDV-WT 亲本毒株由国家口蹄疫参考实验室保存。 大肠杆菌 DH5α 购自深圳康体生命科技有限公司。 pcDNA3.1 载体和 BHK21 细胞为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队保存。
1.2 主要试剂
限制性核酸内切酶（Not Ⅰ、BamH Ⅰ）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司。 DNA Marker 购自北京擎科生物科技股份有限公司。 胶回收试剂盒购自美国 Omega England Biolabs 公司。 T4 DNA 连接酶购自 New England Biolabs 公司。 质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。 Lip3000 脂质体转染试剂（L3000015）购自 Invitrogen 公司。 Trizol 试剂、Prime STAR Max 高保真 DNA 聚合酶均购自宝日医生物技术（北京）有限公司。 反转录酶（Reverse Transcriptase）购自诺唯赞生物科技股份有限公司。 DMEM 细胞培养基购自英潍捷基（上海）贸易有限公司。 胎牛血清（FBS）购自 Biological Industries（BI）公司。 0.05％ EDTA 胰酶购自 Gibco 公司。 组织研磨珠（氧化锆）购自武汉赛维尔生物科技有限公司。 探针一步法 RT-PCR 定量检测试剂盒购自上海百赛生物科技股份有限公司。
1.3 含突变氨基酸全长质粒的构建
根据 O 型口蹄疫病毒全长 cDNA 序列，设计含有 Not Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切位点的 403 位氨基酸（3D-M403A）突变的目的基因片段，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。 经 Not Ⅰ和 BamH Ⅰ酶消化后，胶回收约 3 172 bp 的目的片段，将其连接到 pcDNA3.1（＋）载体上，得到含有突变氨基酸的全长质粒 pFMDV-3D-M403A-O，得到的质粒送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。
相关新闻推荐
2、白马耳组织成纤维细胞体外培养、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线绘制（一）