牛源解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力测定、抗逆性及药敏试验（二）
1.3产酶条件优化
对产酶能力强的菌株进行单因素试验:设定发酵培养基初始pH为6，接种量为1%，发酵时间分别为12、24、36、48、60 h，测定发酵时间对菌株产酶能力的影响;设定发酵培养基的初始pH为6，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，发酵时间为前面得出的最佳发酵时间(48 h)，测定接种量对菌株产酶能力的影响;设定发酵培养基初始pH分别为5、6、7、8、9，接种量和发酵时间为前面得出的最佳接种量(4%)和最佳发酵时间(48 h)，测定发酵培养基初始pH对菌株产酶能力的影响。
1.4药敏试验
选择8种抗菌药物(氯霉素、新生霉素、阿莫西林、新霉素、庆大霉素、红霉素、链霉素、利福平)，以纸片法对待测菌株进行药物敏感性测定，以了解待测菌株对抗菌药物的耐药性。选取药敏纸片，按照药敏纸片扩散法操作步骤进行相关菌株的药敏试验。
1.5抗逆性试验
1.5.1人工胃液耐受性
将待测菌株接种到NB培养基中，摇瓶发酵24 h，将待测菌株发酵液按接种量10%接种于10 mL pH分别为2.0、4.0的人工胃液中处理3 h，以0 h的样品作为对照，计算菌株存活率。
1.5.2人工肠液耐受性
将待测菌株接种到NB培养基中，摇瓶发酵24 h，取1 mL待测菌株发酵液接种到9 mL胆盐浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%的人工肠液中处理3 h，以0 h的样品作对照，计算菌株存活率。
1.6体外抑菌试验
采用琼脂扩散法进行体外抑菌试验。以大肠杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌，吸取100μL病原菌菌液，稀释、涂布后打孔(打孔器直径9 mm)，再分别吸取待测菌株的发酵液、上清液、菌悬液100μL加入孔内，置于30℃恒温培养箱培养1 d，重复3次，测量抑菌圈直径，计算圈径比(抑菌圈直径/打孔直径)。
1.7溶血活性试验
以金黄色葡萄球菌为阳性对照，将待测菌株及金黄色葡萄球菌划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃培养1 d，观察有无溶血圈产生。
1.8全基因组测序分析
采用三代测序的方法进行全基因组测序分析(委托南宁国拓生物科技有限公司完成)，使用prokka工具对细菌基因组进行注释，通过比对CAZy、GO、VFDB、CARD数据库，对细菌基因组进行注释。
1.9数据处理及统计学分析
用Excel 2016软件进行数据处理，试验结果使用GraphPad Pism 9.5软件进行单因素方差分析及作图。
2结果与分析
2.1目标菌株的初筛结果
根据单菌落大小、形态、颜色挑取不同形态的细菌进行纯化，最终选定15株细菌。采用刚果红染色法对选定的菌株进行初筛，得到1株能产生透明圈的菌株(图1)，将其命名为GXUN13068-1，测量其透明圈直径为31.23 mm，菌落直径为16.17 mm，EI为1.93。
图1菌株GXUN13068-1水解透明圈
2.2菌株鉴定结果
2.2.1菌株形态特征
菌株GXUN13068-1菌落表面有褶皱，菌落颜色为灰白色，菌落边缘呈不规则状，表面干燥呈磨砂样，有火山口状凸起(图2-a);经革兰氏染色，显微镜观察菌体为革兰氏阳性菌，呈蓝紫色，短杆状(图2-b);扫描电子显微镜下测量菌体长约1.52μm，宽约0.65μm(图2-c)。
图2菌株GXUN13068-1的菌落形态(a)、革兰氏染色(b)及扫描电子显微镜镜检形态(c)
2.2.2生理生化特征
菌株GXUN13068-1的生理生化鉴定结果生理生化鉴定结果见表1。根据鉴定结果，该菌株符合芽孢杆菌的生理生化特征。
表1菌株GXUN13068-1的生理生化鉴定结果
2.2.3菌株16S rDNA的序列分析
将菌株GXUN13068-1的16S rDNA测序结果上传至EzBioCloud进行比对分析，结果显示，菌株GXUN13068-1与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的序列相似性为99.86%。
2.3菌株GXUN13068-1产酶发酵条件的优化结果
当发酵培养基的初始pH为6，接种量为1%时，发酵时间对菌株GXUN13068-1产酶能力的影响如图3所示。当发酵时间为48 h时，菌株GXUN13068-1的产酶能力达到最大，所产纤维素酶活力为103.24 U/mL。
图3发酵时间对菌株GXUN13068-1产酶能力的影响数据柱标注不同小写字母表示处理间有显著差异(P<0.05)。下图同。
当发酵培养基的初始pH为6，发酵时间为48 h时，接种量对菌株GXUN13068-1产酶能力的影响如图4所示。当接种量为4%时，菌株GXUN13068-1的产酶能力达到最大，所产纤维素酶活力为113.23 U/mL。
图4接种量对菌株GXUN13068-1产酶能力的影响
当接种量为4%，发酵时间为48 h时，发酵培养基初始pH对菌株GXUN13068-1产酶能力的影响如图5所示。当发酵培养基初始pH为9时，菌株GXUN13068-1的产酶能力达到最大，所产纤维素酶活力为126.37 U/mL。
图5发酵培养基初始pH对菌株GXUN13068-1产酶能力的影响
2.4药敏试验结果
菌株GXUN13068-1对8种抗菌药物的敏感性如图6和表2所示。根据美国临床标准委员会(NCCLS)的试验要求和标准，菌株GXUN13068-1对新生霉素、庆大霉素、氯霉素、红霉素、链霉素均表现为敏感，对新霉素表现为中度敏感，对利福平和阿莫西林表现出耐药性。
图6菌株GXUN13068-1的药敏试验结果1:氯霉素chloramphenicol;2:新生霉素neomycin;3:新霉素neomycin;4:庆大霉素gentamicin;5:阿莫西林amoxicillin;6:红霉素erythromycin;7:链霉素streptomycin;8:利福平rifampicin。
表2菌株GXUN13068-1对8种抗生素的敏感性
S:敏感;I:中介;R:耐药。
2.5抗逆性试验结果
2.5.1人工胃液耐受性
菌株GXUN13068-1对人工胃液的耐受性见表3。菌株GXUN13068-1的存活率随着人工胃液pH的升高有下降趋势，pH 2.0和pH 4.0的人工胃液处理3 h的存活率均在70%以上，说明该菌株对人工胃液具有良好的耐受性。
表3菌株GXUN13068-1对人工胃液的耐受性
2.5.2人工肠液耐受性
菌株GXUN13068-1对人工肠液的耐受性见表4。经胆盐浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%的人工肠液处理3 h后，菌株GXUN13068-1的存活率均在85%以上，说明该菌株对人工肠液有良好的耐受性。
表4菌株GXUN13068-1对人工肠液的耐受性
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