益生菌罗伊氏乳杆菌抑制轮状病毒感染的实验研究
1.6 免疫荧光灶法检测罗伊氏乳杆菌作用后Caco-2细胞中病毒滴度
Caco-2细胞以每孔5×104个的密度接种于24孔细胞培养板，待细胞长至80%后，将Caco-2细胞分为阴性对照组（NC组，Caco-2细胞不进行任何处理）、阳性对照组（PC组，Caco-2细胞未感染罗伊氏乳杆菌）和107、108、109及1010 CFU·mL－1罗伊氏乳杆菌组［分别采用107、108、109和1010 CFU·mL－1罗伊氏乳杆菌与Caco-2细胞共孵育 1 h 后，每孔加入感染复数（multiplicity of infection，MOI）为1的RV，感染细胞1 h，弃去病毒液，PBS缓冲液润洗1次，每孔加入2 mL含0.5 mg·L－1猪胰酶的DMEM培养液］。各组细胞维持培养12 h后进行免疫荧光实验：吸弃维持液，PBS缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定，加入0.1% Triton X-100作为细胞通透剂，1% BSA封闭后加入以鼠源RV VP6一抗和FITC标记的山羊抗鼠二抗，倒置荧光显微镜下观察并记录各孔免疫荧光灶数，计算病毒滴度。病毒滴度（FFU·mL－1）=（最高稀释倍数孔荧光灶数的平均值+相邻较低稀释倍数孔荧光灶数的平均值）/［2×相邻较低稀释倍数×每孔加入的病毒稀释液的体积（mL）］。
1.7 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测不同浓度罗伊氏乳杆菌作用后Caco-2细胞中RV VP6基因拷贝数
采用5×108、10×108、50×108、100×108、200×108和500×108 CFU·mL－1罗伊氏乳杆菌侵袭Caca-2细胞1 h，PBS缓冲液洗涤5次，每孔加入MOI为0.01的RV感染Caco-2细胞1 h，12 h后收集各组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA后，采用RT-qPCR法扩增检测RV VP6基因拷贝数，引物序列见表1。RT-qPCR的具体步骤按照TB Green® Premix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）说明书操作。每个样品平行测定3次。扩增后得到Ct值，并绘制标准曲线，计算病毒基因拷贝数，RV VP6基因标准曲线由实验室前期构建质粒所得：Y=-0.298 7X+16.613（R2=0.999 7，Y代表Lg病毒拷贝数，X代表Ct值）。
表1 PCR引物序列
| Gene | Primer sequence |
|---|---|
| VP6 |
F 5‘-ACTTGGAACAACTTTGCTGAAC-3’ R 5‘-AGCGAGTCTGATTGAGGTGC-3’ |
| IL-1β |
F 5‘-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3’ R 5‘-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3’ |
| TNF-α |
F 5‘-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3’ R 5‘-TGGGCTACAGGCTTGTCACT-3’ |
| IL-8 |
F 5‘-CAGGCCACAGACGGACATG-3’ R 5‘-GGACGAAGATGCCTAGGTTAAGG-3’ |
| IL-10 |
F 5‘- GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3’ R 5‘-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG-3’ |
| IFN-γ |
F 5‘-CATTCATGAGTATTGCCAAGTTTG-3’ R 5‘-GCTGGATTCCGGCAACAG-3’ |
| GAPDH |
F 5‘-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ R 5‘-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’ |
1.8 罗伊氏乳杆菌与RV体内共培养动物模型建立
将25窝SPF级昆明乳鼠随机分为对照组、RV组（感染SA11毒株）、Ab-NC组（抗生素处理耗竭肠道菌群）、Ab-RV组（耗竭肠道菌群后感染SA11毒株）和Ab-Lac-RV组（耗竭肠道菌群，并感染罗伊氏乳杆菌后感染SA11毒株），每组5窝，每窝8~9只乳鼠。Ab-NC组、Ab-RV组和Ab-Lac-RV组乳鼠连续3 d灌胃四联抗生素100 μL（新生霉素1 g·L－1、万古霉素0.5 g·L－1、甲硝唑1 g·L－1 和氨苄西林1 g·L－1）。每日收集乳鼠粪便，采用LB平板有氧培养和MRS琼脂平板厌氧培养检测肠道菌群耗竭情况。RV组和Ab-RV组乳鼠连续10 d灌胃6.5 Lg FFU·mL－1 SA11毒株，Ab-Lac-RV组乳鼠上午感染100 μL 1010 CFU·mL－1罗伊氏乳杆菌，下午感染6.5 Lg FFU·mL－1 SA11毒株。NC组和Ab-NC组乳鼠灌胃PBS缓冲液，持续灌胃10 d。分别于灌胃第2、4、6、8和10天收集各组乳鼠粪便样本，用于后续实验。
1.9 RT-qPCR法检测各组乳鼠粪便中RV VP6基因拷贝数和结肠组织中免疫因子mRNA表达水平
取各组乳鼠粪便，均称取相同质量，加入等量PBS缓冲液，振荡器震荡3次，每次15 s，4 ℃、12 000 r·min－1离心5 min，取250 μL上清，TRIzol法提取总RNA，反转录为cDNA，采用RT-PCR法检测RV VP6基因拷贝数，参考“1.7”中方法。
收集灌胃第4天各组乳鼠结肠组织，称取相同结肠组织质量，加入800 μL PBS缓冲液和5颗研磨珠，置于研磨机上研磨2 min，离心后取400 μL上清，TRIzol法提取RNA，反转录为cDNA，根据白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-8、IL-10、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因设计特异性引物，进行RT-qPCR实验，以GAPDH作为内参基因，采用2—ΔΔCt法计算各免疫因子mRNA表达水平。引物序列见表1。
1.10 统计学分析
采用Origin2018和Graphpad Prism 9.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中RV VP6基因拷贝数、免疫荧光灶数和病毒滴度，各组乳鼠粪便中RV VP6基因拷贝数和结肠组织中免疫因子mRNA表达水平均符合正态分布，以x±s
表示。多组样本间均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
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