约氏乳杆菌G1无细胞上清液对常见致病菌的抑制效果
1.2.11 菌株药物敏感性测定
使用丹麦Biosense公司oCelloScope快速药敏实验系统进行测定。挑取单个菌落接种于5 mL MRS肉汤培养基，37℃培养24 h。用新鲜MRS肉汤培养基将菌液浓度调节至约1×10^6 CFU/mL。在无菌96孔板中，预先加入系列稀释的抗生素溶液（最终浓度涵盖CLSI折点范围），每孔再加入等体积的上述菌悬液，使最终体积为200 μL，并设置不含抗生素的阳性对照孔和不含菌液的阴性对照孔。将孔板置于oCelloScope系统中，于37℃下连续培养16-20 h，系统每30分钟自动成像并分析各孔内的微生物生长情况。通过比较含药孔与阳性对照孔的实时生长曲线，系统软件根据2024版美国临床和实验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute, CLSI) M62文件标准中乳酸菌属嗜酸乳杆菌的折点，自动判定菌株对青霉素、亚胺培南、氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢克洛、左氧氟沙星、克林霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、氯霉素、阿奇霉素、红霉素和头孢西丁等14种抗生素的敏感性（敏感S、中介I或耐药R）。
1.3 统计与分析
采用GraphPad Prism10软件对试验数据进行单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示，P<0.05判定为显著差异。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离鉴定
结果显示，从和田黑鸡肠道内容物分离出一株候选菌，命名为G1。由图1可见，分离菌菌落表面光滑，边缘整齐，呈白色、圆形、不透明；菌体呈球状，成对或短链排列，革兰氏染色呈阳性。
图1 分离菌的形态特征
分离菌生理生化鉴定结果见表1。结果显示，G1可以利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、蔗糖、乳糖、1%马尿酸钠，初步鉴定为约氏乳杆菌。
表1 分离菌生理生化鉴定结果
| 产品 | 七叶苷 | 纤维二糖 | 麦芽糖 | 甘露醇 | 水杨苷 | 山梨醇 | 蔗糖 | 棉子糖 | 菊糖 | 乳糖 | 1%马尿酸钠 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 结果 | + | + | + | + | + | - | + | - | - | + | + |
注：+表示阳性，-表示阴性。
2.2 分离菌分子生物学鉴定结果
结果显示，分离菌16S rDNA的PCR扩增产物长度约为1500bp(见图2)，测序结果判定为其为乳杆菌属，与约氏乳杆菌LJ(JN012226.1)之间相似度高达100%(见图3)，将该分离菌鉴定为约氏乳杆菌，上传扩增序列获得登录号PX121656.1。
图2 分离菌16S rDNA扩增产物鉴定结果
图3 基于16S rDNA序列构建的系统发育树
2.3 分离菌生长及产酸能力测定结果
图4 分离菌生长曲线与产酸曲线
利用oCelloScope系统实时监测的分离菌G1生长曲线及产酸曲线见图4。结果显示，该系统通过实时成像与生物量分析，清晰揭示了G1菌株的生长动力学：在接种后的2~12 h内，生物量浓度呈指数增长，处于对数生长期，与此同期，培养液pH值迅速由初始值下降至3.8；12 h后，生长进入稳定期，生物量变化趋于平缓，pH值稳定在3.4左右。oCelloScope提供的连续、高时间分辨率数据直观地展示了菌株生长与产酸过程的同步关系。
2.4 分离菌耐酸耐胆盐测定结果
分离菌对酸和胆盐耐受能力测定结果见图5。结果显示，G1的存活率呈现出明显的pH依赖性、胆盐浓度依赖性和时间依赖性。在极端条件(pH 2.0)下，菌株存活受到严重抑制，处理 1 h存活率为61.7%，处理4h后存活率急剧下降至6.5%，与对照组相比差异极其显著(P<0.0001)；而在pH3.0和pH4.0条件下，菌株表现出更好的耐受性，其中在pH3.0时培养1h的存活率为79.3%，培养4h的存活率为109.3%；在pH4.0时，培养1h与培养4h存活率均与对照组无显著差异(P>0.05)。同时，胆盐胁迫效应明显，其中在0.3%胆盐中处理1h存活率可达84.5%，与对照组无显著差异(P>0.05)，处理4h存活率可达55.4%，但当浓度升至0.5%时，处理1h存活率为40.6%，处理4h存活率则下降至26.4%，均与对照组存在极其显著差异(P<0.0001)。表明G1对酸和胆盐具有一定的耐受能力，但该能力与胆盐浓度和耐受时间具有一定的关系。
图5 分离菌在酸环境和胆盐环境下的存活率
2.5 分离菌疏水率和自聚集率测定结果
分离菌疏水率和自聚集率测定结果见图6。结果显示，G1的自聚集率为(41.19±2.26)%，疏水率为(63.12±2.78)%，表明该菌株可能具有良好的肠道定植能力。
图6 分离菌的自聚集率与疏水率
2.6 分离菌上清液抑菌能力测定结果
分离菌上清液的抑菌能力测定结果见图7。结果显示，G1上清液对于金黄色葡萄球菌，500mg/mL浓度组抑菌圈直径最大，为(28.90±0.52)mm，抑菌效果极显著强于250mg/mL和125mg/mL组(P<0.0001)；对于大肠埃希氏菌和沙门氏菌，500mg/mL组抑菌效果均极其显著强于250mg/mL和125mg/mL浓度组(P<0.0001)。表明G1对3种质控菌的抑菌效果均表现出显著的浓度依赖性，且随着上清液浓度的升高，抑菌作用显著增强。
图7 不同浓度G1无细胞上清液对致病菌的抑制作用
相关新闻推荐
1、3种植物精油对调理牛排腐败贮藏过程优势腐败菌生长抑制情况及细菌生长曲线（三）
2、CSP-MDA-7/IL-24重组蛋白肝靶向肽-抗肿瘤肽的最佳表达条件（一）
3、化合物C6对鼠诺如病毒和李斯特菌的抗感染活性及细菌生长动力学分析（一）