新疆和田黑鸡源约氏乳杆菌G1的分离与分子鉴定
摘要
研究旨在从和田黑鸡肠道内容物中筛选具有潜在应用价值的益生菌候选菌株，为后续开发基于宿主适应性的微生态制剂奠定基础。试验通过革兰氏染色、细菌生化鉴定及16S rDNA同源比对鉴定菌种，建立生长曲线和产酸曲线，探究菌株对胃肠道环境的耐受性和定植能力，通过琼脂双层平板法测定菌株无细胞上清液对常见致病菌的抑制能力，通过溶血性试验和药物敏感性试验评估菌株的安全性。结果显示：分离获得1株益生菌G1，鉴定为约氏乳杆菌，菌落呈白色、圆形，属于革兰氏阳性球菌；该菌培养2~12 h处于对数生长期，pH值快速降至3.8；该菌在pH 2.0条件下培养 1 h和 4 h存活率分别为 61.7%和 6.5%，pH 3.0条件下分别为 79.3%和109.3%；该菌在0.3%胆盐中培养1h和4h存活率分别为84.5%和55.4%，0.5%胆盐中分别为40.6%和26.4%，表明菌株具有良好的胃肠道耐受性；该菌自聚集率为41.2%，疏水率为63.1%，具备较好的定植潜力；该菌无细胞上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均具有抑制作用；该菌无溶血性，仅对丁胺卡那霉素和头孢西丁耐药，对青霉素和阿奇霉素中度敏感，对其余10种抗生素敏感。综上，G1菌株具有优良的益生特性和安全性，可作为畜禽益生菌开发的候选菌株。
随着畜牧业可持续发展理念的深化，益生菌因其在改善动物肠道健康、增强免疫功能和抑制病原菌等方面的潜力，逐渐成为抗生素替代策略的研究热点。乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)作为肠道微生物群的重要组成部分，已被证实可通过调节宿主微生态平衡、增强屏障功能及代谢调控等机制发挥益生作用。其中，约氏乳杆菌(Limosilactobacillus johnsonii)作为一种具有优良益生特性的乳酸菌，在调节肠道炎症反应、拮抗致病菌定植及促进营养物质吸收等方面展现出独特优势，但其菌株特异性功能仍亟待深入挖掘。
新疆地方品种和田黑鸡长期适应干旱、高寒的特殊生态环境，形成了独特的肠道微生物群落结构，可能蕴藏具有地域适应性和宿主特异性的潜在益生菌资源。然而，目前针对新疆特色畜禽品种肠道乳酸菌多样性及其功能特性的系统性研究仍较为匮乏。已有研究表明，宿主遗传背景与地理环境共同塑造了肠道菌群的组成。因此，从和田黑鸡肠道中筛选具有优良特性的乳酸菌菌株，不仅有助于揭示其与环境适应的共生机制，还可为开发本土化畜禽微生态制剂提供理论依据。
本研究以和田黑鸡肠道内容物为研究对象，通过选择性培养基分离、分子生物学鉴定获得一株约氏乳杆菌纯培养菌株，并系统评价其抗逆性、黏附能力及抑菌活性等体外益生特性，旨在筛选具有潜在应用价值的益生菌候选菌株，为后续开发基于宿主适应性的微生态制剂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品与菌株
本试验分离细菌所用的和田黑鸡肠道内容物来自和田地区某养鸡场的健康和田黑鸡。质控菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923、大肠埃希氏菌(Escherichia coli) ATCC 25922和沙门氏菌(Salmonella) ATCC 14028，均由新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室提供。
1.1.2 主要试剂
MRS (Manrogosa sharpe)培养基、LB (Luria-Bertani)培养基、琼脂粉、牛胆盐和乳酸菌微量生化鉴定管均购自青岛海博生物技术有限公司。DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3 主要仪器
oCelloScope微生物生长曲线分析系统购自丹麦Biosense公司；高速台式离心机(H1750型)购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；光学显微镜(DM500型)购自上海徕卡显微系统有限公司；pH计(PJS-3C型)购自上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离与纯化
取1g左右和田黑鸡肠道内容物在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中重悬，37℃恒温摇床培养30 min。按照5%的接种量，取PBS重悬液加入MRS肉汤中，37℃恒温摇床培养24h，划线接种于MRS琼脂培养基上，37℃恒温培养24h，挑取具有乳酸菌形态的单菌落纯化培养。对单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态，作初步鉴定。
1.2.2 菌株生化鉴定
应用乳酸菌微量生化鉴定管对候选菌株进行生化鉴定，参照《伯杰氏系统细菌手册》确定细菌种属。
1.2.3 16S rDNA基因扩增及序列分析
按照DNA提取试剂盒说明书操作，提取目的菌株DNA，用细菌 16S rDNA通用引物进行 PCR扩增，扩增结束后，将 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对 PCR阳性产物测序，在 NCBI-BLAST中比对分析测序结果，采用 MEGA6.0软件构建系统发育树。