罗伊氏乳杆菌调节免疫因子表达抑制轮状病毒复制的实验证据
2 结 果
2.1 罗伊氏乳杆菌鉴定和生长曲线
罗伊氏乳杆菌经活化和培养，于MRS琼脂平板上生长良好，形态圆润，呈圆形、光滑和乳白色的凸起样菌落，且边缘较整齐。革兰染色后菌体呈紫色、不规则和方形杆状。见图1。罗伊氏乳杆菌经16s rDNA测序后序列同源性为99%，提示罗伊氏乳杆菌活化成功。见图2。罗伊氏乳杆菌活菌数与A值呈线性关系，回归分析标准曲线为Y=0.437 5X+0.000 6，R2=0.999 4。培养0~2 h，细菌处于对数生长期，细菌生长迟缓；培养2~14 h，细菌快速生长，并于培养14~16 h时细菌生长趋于稳定，培养16 h时达到细菌生长速率顶峰，随后进入衰亡期。见图3。
图1 罗伊氏乳杆菌菌落大体形态（A）和革兰染色观察菌落形态表现（B）
图2 16s rDNA序列构建进化树
图3 罗伊氏乳杆菌标准曲线和生长曲线
2.2 不同浓度罗伊氏乳杆菌感染后Caco-2细胞存活率
采用5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL－1 罗伊氏乳杆菌感染Caco-2细胞，Caco-2细胞存活率均>90%，因此后续实验采用5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL－1 罗伊氏乳杆菌进行细胞感染。见图4。
图4 罗伊氏乳杆菌感染后Caco-2细胞存活率
2.3 各组Caco-2细胞中RV VP6基因拷贝数
与PC组比较，5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL－1 罗伊氏乳杆菌组Caco-2细胞中RV VP6基因拷贝数均明显降低（P<0.01）。
表2 各组Caco-2细胞中RV VP6基因拷贝数 (n=3， x±s)
| Group | Copy number (copies·mL－1) |
|---|---|
| PC (Lactobacillus reuteri, CFU·mL－1) | 2.085×108±1.406×107 |
| 5×108 | 6.903×107±1.435×106* |
| 10×108 | 1.456×107±6.986×105* |
| 50×108 | 7.016×106±1.772×105* |
| 100×108 | 4.444×106±2.653×105* |
| 200×108 | 2.736×106±1.463×105* |
*P<0.01 compared with PC group.
2.4 各组Caco-2细胞中病毒滴度
与PC组［（6.383±0.021） Lg FFU·mL－1］ 比较，107、108、109和1010 CFU·mL－1罗伊氏乳杆菌组Caco-2细胞中病毒滴度［（6.247±0.042）、（6.097±0.091）、（6.030±0.075）和（5.837±0.050） Lg FFU·mL－1］均明显降低（P<0.01）。见图5。
图 5 免疫荧光灶法检测各组Caco-2细胞中病毒滴度（×10）
2.5 乳鼠肠道菌群耗竭模型和罗伊氏乳杆菌移植模型验证
与对照组比较，Ab-NC组、Ab-RV组和Ab-Lac-RV组乳鼠肠道菌群菌落数量均明显减少，乳鼠肠道菌群耗竭成功。见图6和7。
图6 LB平板检测各组乳鼠肠道菌群耗竭情况
图7 MRS平板检测各组乳鼠肠道菌群耗竭情况
2.6 各组乳鼠粪便中RV VP6基因拷贝数
灌胃第2和4天，与RV组比较，Ab-RV组乳鼠粪便中RV VP6基因拷贝数明显降低（P<0.05）。灌胃第4、6、8和10天，与Ab-RV组比较，Ab-Lac-RV组乳鼠粪便中RV VP6基因拷贝数明显降低（P<0.05）。
表3 各组乳鼠粪便中RV VP6基因拷贝数 (n=3， x±s)
| Group | Copy number (copies·mL-1) (t/d) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | |
| RV | 5.984±0.016 | 5.858±0.008 | 4.297±0.040 | 3.910±0.021 | 3.300±0.029 |
| Ab-RV | 5.409±0.004* | 5.188±0.009* | 4.932±0.012 | 4.097±0.032 | 3.742±0.031 |
| Ab-Lac-RV | 5.428±0.012 | 4.970±0.018△ | 4.335±0.040△ | 4.070±0.060△ | 3.582±0.043△ |
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